Kromatográfia

A kromatográfia, amely a görög χρώμα: kroma, szín és γραφειν: grafein írni szavak összetétele, egy keverékek elválasztására használatos laboratóriumi módszercsalád neve.

A technika lényege egy az ún. mozgó (mobil) fázisban más néven eluensben oldott keveréknek egy álló (statikus) fázison való áthajtása, melynek során a vizsgálandó anyag elválik az elegyben található további molekuláktól.

A módszert két alapvető célra használjuk:

• preparatív vagy
• analitikai.

A preparatív kromatográfia az elválasztott vegyületek további feldolgozása a végső cél, azaz egy tisztítási műveletről beszélhetünk. Az analitikai kromatográfia általában kisebb anyagmennyiségekkel dolgozik és célja az analit relatív arányának meghatározása a keverékben. A két cél nem zárja ki egymást.

A kromatográfia története

A kromatográfia története a XIX. század közepétől a XXI. századig ível. A kromatográfia nevét a XX. század első évtizedében kapta, használata is ekkor kezdődött elsősorban növényi pigmentek, például klorofill elválasztására. Az 1930-as és 1940-es években kifejlesztett új kromatográfiás módszerek elválasztási folyamatok és kémiai analitikai feladatok széles körére tették alkalmassá a technikát, különösen a biokémia területén.

Több hasonló eljárást fejlesztettek ki a XIX. század során (sőt még korábban is), de az első igazi kromatográfia Mihail Szemjonovics Cvet orosz botanikus nevéhez köthető, aki klorofillon végzett kísérlete közben egy függőlegesen elhelyezett kalcium-karbonáttal töltött üvegcsövet használt növényi pigmentek elválasztására a XX. század első évtizedében. A módszert is ő nevezte el.

A kromatográfia modern formája Archer John Porter Martin és Richard Laurence Millington Synge az 1940-1950-es években végzett munkásságát követően alakult ki. Ők fektették le a megoszlási kromatográfia alapelveit és alapvető technikáit és munkájuk nyomán a megindult a kromatográfiás módszerek számos fajtájának (papír kromatográfia, gáz kromatográfia, valamint a manapság nagy teljesítményű folyadék kromatográfiaként ismert eljárás) gyors fejlődése. A megoszlási kromatográfia terén végzett munkásságukért Archer John Porter Martin és Richard Laurence Millington Synge 1952-ben Nobel-díjat kaptak.

Azóta a technológia gyorsan fejlődött. A kutatók megállapították, hogy a Cvet kromatográfiáját megalapozó elvek számos módon felhasználhatók, így alakulhatott ki a kromatográfia alábbiakban bemutatott számos válfaja. Ugyanakkor a kromatográfia technikai teljesítőképessége is folyamatosan javult, egyre inkább lehetővé téve nagyon hasonló molekulák elválasztását is.

Szakkifejezések

• Analitnak nevezzük a kromatográfia során elválasztandó anyagot.
• Az analitikai kromatográfia az analit(ok) mintában való jelenlétének bizonyítását (minőségi meghatározás) valamint lehetőleg koncentrációjának meghatározását (mennyiségi elemzés) jelenti.
• Kötött vagy immobilizált fázisnak a hordozó szemcsékhez vagy az oszlop belső falához kovalens kötéssel kötött álló fázist nevezzük.
• Kromatogram a kromatográf láthatóvá tett kimeneti jele. Optimális elválasztás esetén a kromatogram különböző csúcsai vagy mintázatai az elválasztandó keverék különböző komponenseinek felelnek meg.

Az x koordináta a retenciós idő, az y koordináta pedig a rendszerből kilépő analit(ok) keltette válasz jel nagyságát. Az érzékelő berendezés lehet például spektrofotométer, tömeg spektrométer vagy számos más típusú detektor. Optimális rendszer esetén a jel arányos az elválasztott analit koncentrációjával.

• Kromatográf a készülék mellyel lehetséges a megfelelő szintű elválasztás kivitelezése, például gázkromatográf vagy folyadék kromatográf.
• A kromatográfia fizikai elválasztási módszer, ahol az elválasztandó komponensek két fázis között oszlanak meg, ezek közül az egyik helyhez kötött (álló fázis), míg a másik adott irányba mozog (mozgó fázis).
• A mozgó fázis vagy eluens egy adott irányban áramlik. Lehet folyadék (LC vagy CEC), gáz (GC) vagy szuperkritikus folyadék (szuperkritikus folyadék kromatográfia SFC). Alternatív definíció szerint a mozgó fázis az elválasztandó / vizsgálandó mintát és mintát a kolonnán átvivő oldószert tartalmazza. A mozgó fázis keresztülhalad a kromatográfiás oszlopon (az álló fázison), ahol a minta kölcsönhatásba lép az állófázissal és megtörténik az elválasztás.
• Effluensnek nevezzük az oszlopról távozó mozgó fázist.
• A preparatív kromatográfia célja egy adott anyag további felhasználásra alkalmas mennyiségének tisztítása, nem pedig minőségi vagy mennyiségi meghatározása.
• A retenciós idő az adott analitnak adott körülmények között a rendszeren (a kolonna bemenettől a detektorig) való áthaladásához szükséges időtartam.
• A minta a kromatográfiával vizsgált anyag. Állhat egyetlen összetevőből vagy több komponens elegye is lehet. Ahogy a mérés során kezeljük a mintát, a vizsgált analito(ka)t tartalmazó fázist vagy fázisokat nevezzük mintának, míg a mérés során minden a vizsgált mintától elválasztott számunkra érdektelen részt hulladékként tekintünk.
• Oldott anyag megoszlási kromatográfiában a minta komponenseit jelenti
• Oldószer bármely anyag, amely képes más anyagokat oldatba vinni, különösen folyadékkromatográfiában a folyékony mozgó fázis.
• Álló fázis a kromatográfiás eljárás során helyben rögzített anyag, mint például vékonyréteg kromatográfiában a szilika réteg.

A kromatográfia fajtái a kromatográfiás ágy alakja szerint

Oszlopkromatográfia

Oszlopkromatográfiás elválasztási technika esetén az állófázis egy csőben található. A szilárd állófázis szemcséi vagy a hordozóra felvitt folyékony állófázis a cső teljes térfogatát megtöltheti (töltött oszlop) vagy a cső fala mentén koncentrálódhat nyitott, akadálymentes utat hagyva a mozgó fázisnak a cső középső részén (nyitott cső oszlop). A közegen való áthaladás sebesség különbségét a minta különböző retenciós ideiből számoljuk.

1978-ban W.C. Still új módosítását vezette be, melyet flash oszlop kromatográfiának nevezett. Az eljárás nagyon hasonlít a hagyományos oszlop kromatográfiához, az eltérés csak annyi, hogy az oldószert nyomás alkalmazásával visszük át az oszlopon. Így a legtöbb elválasztás kevesebb, mint 20 perc alatt kivitelezhető, és az elválasztás is jobb, mint a hagyományos módszernél. A modern flash kromatográfiás rendszereket előre csomagolt műanyag oszlopként árulják és az oldószert a töltött oszlopon vezetik keresztül. A rendszert detektorokkal vagy frakció szedőkkel bővíthetjük lehetővé téve az automatizálást. A gradiens pumpák bevezetése gyorsabb elválasztást és kisebb oldószer felhasználást eredményezett.

Léteznek olyan segédprogramok a flash kolonnák sikeres fejlesztéséhez, melyek megbecsülik az analitok retenciós térfogatát, a sávok szélességét, az egyes analitokat tartalmazó frakciók számát és a szomszédos csúcsok közötti elválást. Így a felhasználó még a flash kolonna használatba vétele előtt kiválaszthatja a preparatív elválasztáshoz szükséges optimális paramétereket.

Az expanded bed adsorption (EBA) az oszlopkromatográfia egy speciális változata, ahol a hagyományos szilárd fázisú töltött oszlop helyett, a oszlopban a szemcsék fluidizált állapotban vannak. Ezáltal lehetséges a kezdeti tisztítási lépések, mint például a centrifugálás és a szűrés elhagyása tenyészetek vagy roncsolt sejtek esetén.

Síkkromatográfia

Klorofill komponenseinek elválasztása vékonyréteg kromatográfiával

A síkkromatográfia olyan elválasztási technika, ahol az állófázis síkban helyezkedik el vagy sík lemezre viszik fel. Ez a sík lehet papír, melyet önmagában használunk vagy melyet valamilyen anyaggal impregnálva kapjuk az állófázist (papírkromatográfia). A másik lehetőség, hogy szilárd szemcsékből álló réteget viszünk valamilyen hordozóra, például üveglemezre vagy alumínium fóliára (vékonyréteg kromatográfia). A minta elegyben levő különböző vegyületek eltérő távolságra vándorolnak attól függően, hogy milyen erősen kötődnek az állófázishoz a mozgó fázishoz viszonyítva. Az egyes vegyületekre jellemző visszatartási tényező (angolul retardation factor - R_f) segíthet az ismeretlen anyagok azonosításában.

Papírkromatográfia

Ennél az eljárásnál egy speciális kromatográfiás papírcsík egyik végére cseppentjük fel a mintaoldatot. A papírcsíkot vékony rétegben oldószert tartalmazó edénybe állítjuk, melyet ezután lefedünk. Ahogy az oldószer végighalad a papíron, áthalad a minta elegyen, amely az oldószerrel együtt vándorolni kezd. A kromatográfiás papír cellulózból készül, ami poláris anyag, így a minta kevésbé poláris komponensei messzebb vándorolnak. A polárisabb vegyületek gyorsabban kötődnek a cellulóz papírhoz, így kevésbé vándorolnak.

Vékonyréteg-kromatográfia (VRK, angolul thin layer chromatography, TLC)

A vékonyréteg kromatográfia (VRK) a papírkromatográfiához hasonlító széles körben alkalmazott laboratóriumi eljárás. Állófázisként papír helyett lapos, inert hordozóra felvitt SiO₂, Al₂O₃ vagy cellulóz helyettesíti. Előnye a papírhoz képest a rövidebb futási idő, a jobb elválasztás és a különböző adszorbensek közötti választás lehetősége. Még jobb elválasztás és mennyiségi meghatározás érhető el nagy teljesítményű VRK angolul High Performance Thin Layer Chromatography HPTLC alkalmazásával.

A kromatográfia fajtái a mozgófázis halmazállapota szerint

Gázkromatográfia (GC)

A gázkromatográfia (GC), amelyet gáz-folyadék kromatográfiaként (GLC) is emlegetnek, olyan elválasztási technika, melynél a mozgó fázis gáz. A gázkromatográfia tetszőleges halmazállapotú, de az esetek többségében gáz- vagy folyadékminták összetételének meghatározására használt analitikai módszer. A mérés két részből áll: mérés-előkészítésből (ami esetünkben a gázelegy alkotóinak a szétválogatása) és magából a mérésből az érzékelő rendszeren.

A mérés előkészítése során először elkeverik a gázneművé alakított (vagy már gáznemű) mérendő mintát egy másik, semleges gázban, az úgynevezett vivőgázban, mely folyamatosan áramlik egy csövön át. A csőből a keverék olyan „akadálycsőbe”, kolonnába kerül, amelyben nagy felületű anyagot tartalmazó szilárd szemcsék helyezkednek el. Ezek a szilárd szemcsék kettős akadályt képeznek. Egyrészt mozgásukban is, másrészt felületi aktivitásukkal is akadályozzák a beáramló gázelegyet. Az ismeretlen gáz összetevőire különbözőképpen hatnak az akadályok, ezért az ismeretlen gázelegy összetevői más és más mértékben lassulnak le a hosszú akadálycsövön való áthaladás során. Az áthaladás végére így különböző sorrendben érkeznek meg, és egymást követve jutnak az érzékelő rendszerbe. A szétválasztott gázokat ezután többféle detektor (hővezető-képességi, lángionizációs) érzékelheti. A lángionizációs (FID) detektorban a gázt hidrogén és oxigén elegyével táplált lángba vezetik, mely a szerves komponenseket ionizálja, a detektor elektródái között folyó áram arányos az adott komponens koncentrációjával. A detektor jele egy feldolgozó egységbe kerül, mely összeköttetésben áll egy kijelzővel. A kijelzőn ezután megjelenik egy görbe, melynek retenciós ideje az anyag minőségére, amplitúdója az anyag mennyiségére jellemző. A mintabeviteltől (injektálástól) a görbe csúcspontjáig eltelt időt retenciós időnek hívjuk. A pontos mennyiség a görbe alatti terület kiszámításával (integrálásával) határozható meg meg. Régebbi típusú gázkromatográfoknál a görbét egy toll rajzolta le egy előre megvonalazott papírlapra. Az újabb típusok már számítógéppel vannak összekötve, így a görbe a monitoron is megjelenik.

Néhány kolonna-töltet a 90-es évekből: SP (szilikon-polimer) 3 és 20%-os, Porapak Q.

A kiértékeléshez gyakran használnak tömegspektrométert is.

Folyadékkromatográfia (LC)

A folyadékkromatográfia (LC) olyan elválasztási technika, melyben a mozgófázis folyadék. Folyadékkromatográfiát akár kolonnán, akár síkban lehet elvégezni. Napjainkban a folyadékkromatográfiás alkalmazásokban általában kis méretű részecskékből álló tölteteket és viszonylag nagy nyomást használnak, ezért a technikát nagy teljesítményű (vagy nagynyomású)folyadékkromatográfiának nevezik.

A HPLC avagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (angulul High Performance Liquid Chromatography, vagy High Pressure Liquid Chromatography) a biokémiában és analitikai kémiában vegyületek elválasztására, azonosítására és mennyiségi meghatározására gyakran használt kromatográfiás eljárás. Az első ilyen jellegű kromatográfot Horváth Csaba magyar professzor építette meg.

A HPLC rendszer a következő alkotórészekből áll: a kromatográfiás töltetet (állófázist) tartalmazó oszlopból (kolonnából), a mobil fázist (mozgó fázist, eluenst) az oszlopon átnyomó pumpából valamint a molekulák retenciós (visszatartási) idejét jelző detektorból. A retenciós idő az álló fázis, a vizsgált molekula és a mozgó fázis közötti kölcsönhatásoktól függ.

A HPLC-s technikában a mintát a szabálytalan vagy gömb alakú szemcsékkel töltött vagy potrózus monolit rétegből készült kolonnán (álló fázis) nyomják keresztül nagy nyomáson valamilyen folyadékkal (mozgó fázis). A mozgó és álló polaritása alapján a HPLC-s alválasztásokat két csoportba sorolhatjuk. Normál fázisú folyadékkromatográfiáról (angolul normal phase liquid chromatography - NPLC) beszélünk, ha ha az állófázis polárisabb mint a mozgó fázis, míg az ellenkezőjét fordított fázisú folyadék kromatográfiának (angolul reversed phase liquid chromatography - RPLC) nevezzük.

Szuperkritikus folyadékkromatográfia (SFC)

Szuperkritikus folyadékkromatográfiában a mozgó fázis a kritikus hőmérsékletet és nyomást megközelítő vagy azt meghaladó folyadék.

A kromatográfia fajtái az elválasztás mechanizmusa szerint

Ioncserés kromatográfia (IEC)

Ioncserés kromatográfia esetén a retenció az töltéssel rendelkező ionok vagy molekulák (akár aminosavak, peptidek és fehérje|fehérjék) és az álló fázishoz kötött töltéssel rendelkező helyek között létrejövő kölcsönhatáson alapszik. Az elválasztást általában kolonnán végzik, de sikkromatográfiás megoldás is elképzelhető. A hagyományos módszereknél az állófázis töltött funkciós csoportokat hordozó ioncserélő gyanta. Az ioncserés kromatográfiát általánosan használják fehérjék tisztítására.

Méretkizárásos kromatográfia (SEC)

A méretkizárásos kromatográfia (angolul: size exclusion chromatography, rövidítve: SEC), melyet gél permeációs kromatográfiaként vagy gélszűréses kromatográfiaként is említenek, méret (vagy pontosabban hidrodinamikai átmérőjük vagy hidrodinamikai térfogatuk) alapján választja el a részecskéket. A kisebb molekulák képesek belépni az állófázis pórusaiba, így lassabban eluálódnak, míg a nagyobb molekulák ki vannak zárva a pórusokból így elúciójuk gyorsabb. Általában csak kis felbontás érhető el vele, ezért általában csak a tisztítás utolsó lépéseként használják. Hasznos még tisztított fehérjék harmadlagos vagy negyedleges szerkezetének meghatározásában. Az eljárást széleskörűen alkalmazzák poliszacharidok molekulatömegének meghatározására.

Affinitáskromatográfia

Az affinitás kromatográfia biokémiai elegyek nagymértékben specifikus biológia kölcsönhatásán alapuló kromatográfiás módszer. Ilyen biológia kölcsönhatás például a az antigén és antitest vagy enzim és szubsztrát illetve receptor és ligandum közötti kapcsolat. Általában molekulák heterogén csoportját tartalmazó oldatból, pl. sejt lizátumból, vérszérumból vagy más biológiai anyagból indulunk ki. A keresett molekula egy jól ismert és definiált tulajdonságát használjuk ki az affinitásos tisztítás során. A célmolekulát megkötjük egy állófázis felületén. Mivel a többi molekula nem képes erre a specifikus kölcsönhatásra, ezek nem kötődnek meg az állófázison. Az állófázist ezután eltávolítjuk az elegyből, mossuk, majd a keresett molekulát eluáljuk az állófázisról.

Speciális technikák

Fordított fázisú kromatográfia

A fordított fázisú HPLC (Reversed phase HPLC, RP-HPLC vagy RPC) esetén az állófázis felülete apoláris, míg a mozgó fázis poláris, jellemzően víz és valamely szerves oldószer elegye. Gyakran használt álló fázis az RMe₂SiCl-dal kezelt szilika, ahol R valamilyen egyenes szénláncú alkil csoport, pl. C₁₈H₃₇ vagy C₈H₁₇. Ilyen álló fázisokat alkalmazva az apolárosabb molekulák retenciós ideje hosszabb, míg a poláros molekulák gyorsabban eluálódnak. Apoláros oldószert adva a mozgó fázishoz növelhetjük, míg hidrofilebb oldószer hozzáadásával pedig csökkenthetjük a retenciós időt. Az RP-HPLC használata annyira elterjedt, hogy gyakran tévesen HPLC-ként emlegetik, minden további pontosítás nélkül.

Szimulált mozgóágyas kromatográfia

Egy elméletileg kidolgozott preparatív célra használandó mozgóágyas kromatográfiától folyamatos működtetése révén nagyobb teljesítményt várhatnánk el, mint egy rögzített ágyas készüléktől. Ennek a gyakorlati kivitelezése azonban nehéz feladat, mert ez egy igen sűrű szuszpenzió (iszap) szabályozott sebességű mozgatásával járna.

A szimulált módszer, ami a rögzített ágyas módszernek közelítő változata, ezt a problémát úgy oldja meg, hogy az ágy mozgatása helyett a minta és az oldószer betáplálási helye és az analit, valamint a hulladék (ill. a második komponens) távozási helye változik folyamatosan, ami azt az érzést kelti mintha az ágy haladna. in , and

A fő hátrány ezzel az, hogy az egyszerű kromatográfiával ellentétben a mintát csak két komponensre tudja szétválasztani.

A módszernek egyre több az alkalmazási területe. Aminosavak egyedi szétválasztására a Google kereső említ egy magyar eredetű angol nyelvű cikket is

Ellenáramú kromatográfia

Az ellenáramú elválasztás (CCD counter current distribution) két nem elegyedő folyadékban választja el az anyagkeveréket. Lényegében a kirázás módszerét használja úgy, hogy az alsó és felső fázist gépesített eljárással folyamatosan frissre cseréli. A frakciókat végül fotometriásan lemérve kapjuk a szokásos kromatogramot.

Királis kromatográfia

Enantiomer párok elválasztása a fizikai és kémiai tulajdonságbeli hasonlóságuk miatt csak olyan sztereospecifikus kémiai kölcsönhatással lehetséges, amelynek során a sztereoizomerek eltérő módon reagálnak. A királis elválasztások két nagy csoportba sorolhatók.

Közvetlen módszerek:

• királis oszlop (állófázis) alkalmazása
• királis eluens (mozgófázis) vagy királis adalék felhasználása

Közvetett módszerek:

• oszlop előtti származékképzés királis reagens segítségével

Királis oszlop

Az állófázis és az elválasztandó vegyület közötti kapcsolat akkor a legstabilabb, amikor az elválasztandó molekula legalább három ponton tud kötődni. Ez az úgynevezett hárompontos illeszkedés modellje, ami számos állófázis tervezésének alapja.

Alkalmas fázisok:

• ciklodextrin alapú fázisok
• Pirkle-féle fázisok (π-sav π-bázis kölcsönhatások)
• királis polimer fázisok
• ligandumcserélő fázisok
• makrociklusos antibiotikum fázisok
• koronaéter fázisok

Királis mozgófázis

Számos racém elegy elválasztható akirális oszlopon a mozgó fázishoz adagolt királis vegyületek alkalmazásával. Királis adalékok például a ciklodextrinek, valamint ellenionként alkalmazott vegyületek, például: (+)-10-kámforszulfonsav.

Oszlop előtti származékképzés királis reagenssel

Királis reagenssel az oszlop előtt az enantiomer párokat származékképzés segítségével diasztereomer párokká alakítjuk, és az eltérő fizikai-kémiai tulajdonságuk miatt már lehetséges az elválasztásuk.

   Minta                           Királis reagens         Diasztereomer termék

(R)-A                                                                   (R)-A-(S)-B
                        +               (S)-B
(S)-A                                                                   (S)-A-(S)-B

3. ábra Diasztereomer pár képzés példája (A= minta, B= reagens)

A királis származékképzők alkalmazásának előnyei és hátrányai is vannak.

Előnyök:

• a felbontás általában nagyobb
• a detektálás alsó határa csökkenthető
• az akirális kolonna olcsóbb
• elúciós sorrend következtethető
• módszerfejlesztés kevésbé időigényes

Hátrányok:

• származékképző reagens tisztasága kritikus
• képződő diasztereomerek moláris abszorbanciája különböző lehet
• racemizáció, illetve kémiai rezolúció léphet fel
• reagensfelesleg zavaró csúcsként jelentkezhet
• az enantiomer visszanyerés további műveleteket igényel
• származékképzés időigényes lehet

Forrás

Ez a szócikk részben vagy egészben a Chromatography című angol Wikipédia-szócikk fordításán alapul. Az eredeti cikk szerkesztőit annak laptörténete sorolja fel.

Külső hivatkozások

• IUPAC Nomenclature for Chromatography
• Chromedia On line database and community for chromatography practitioners
• "Expanded-bed adsorption", at Modern Drug Discovery
• Reversed phase chromatography article (dutch)
• Library 4 Science: Chrom-Ed Series
• Overlapping Peaks Program - Learning by Simulations
• Chromatography Videos - MIT OCW - Digital Lab Techniques Manual
• Chromatography Equations Calculators - MicroSolv Technology Corporation
• Szabad (GPL) kromatográfiás szoftver
• [www.edisonhouse.hu/cikk_eload/kiralis_elvalasztasok.pdf Királis elválasztás]