Proteomika

A proteomika fehérjék teljes körű, összetett, minőségi és funkcionális vizsgálata, és az ezt végző molekuláris biológiai illetve sejtbiológiai résztudományág neve. Módszereinek kifejlesztésében számos kutató működött közre (Anderson - 1998; Tanaka, Fenn - 2002, Nobel-díj).

Proteomika általában 

Amint a humán genetikai kutatási program az emberi genom teljes megismerésével egy új szakaszba lépett, lehetőségként kínálkozott molekuláris információs szinten is értelmezni a sejt élettani alapjait. Az elmúlt évtized ilyen értelemben számos új területet hozott létre, mint potenciális lehetőség a sejt funkcionális-infomatív működésének feltárását illetően. Ennek egyik példája a proteomika, melynek célja fehérjék azonosítása, lokalizációjuk a sejten belül, működésük és szerepük in vivo. A kutatása ezeknek a folyamatoknak ugyanakkor nem könnyű. A viszonylag statikus genomi állapot és a fehérjék dinamikus viselkedésének eltérő mivoltja, a génexpressziós mintázatnak a sejtciklus fázisaiban differenciált működési mechanizmusa, a számos külső stimulus (hőmérséklet, apoptotikus jelek, külső stresszhatások) még inkább megnehezíti az egzakt leírását ennek a dinamikus jelenséghalmaznak. Továbbá megjegyzendő, hogy az ún. alternatív splicing és a poszt-transzlációs folyamatok jelenléte szinte teljesen átértékeli a korábban gondolt egy gén–egy fehérje elméletet.

A jelenlegi proteomikai vizsgálatok két terültre összpontosítanak: a funkcionális proteomika (fehérje aktivitás, jelátvivő útvonalak, multiprotein komplexek) és a expressziós proteomika (szabályzás). Ez utóbbi rendellenes működésű sejtek génexpressziós túl- vagy alulszabályzási folyamatait tanulmányozza, így diagnosztikus felhasználást is nyerhetnek. A funkcionális proteomika molekuláris hálózatok és útvonalak térbeli és időbeli kiterjedését kutatja élő sejtekben.

A génszekvencia vizsgálatok általánossá válásával lehetővé vált számos eddig ismeretlen fehérjefunkció feltárása. A kutatások több mindeddig ellentmondásosnak tűnt jelenséget magyaráztak meg segítségével, amik például génkódolással, kromoszómák lokalizációjával, szabályzó mechanizmusokkal voltak kapcsolatosak.

Fehérjeazonosítás spektrometriás módszerekkel

Elválasztásukat gyakran egy- vagy kétdimenziós (2D) elektroforézissel, MALDI tömegspektrometriás eljárással végzik. A fehérjéket kinyerik a gélből, jódacetamiddal kezelik, hogy diszulfid-hidak képződését megakadályozzák, majd tripszinnel kezelik. A kapott terméket MALDI-MS technikával vizsgálják 

MALDI-MS 

A MALDI (matrix associated laser desorption ionisation) az egyik legelterjedtebb analitikai biomolekuláris eljárás peptidek, fehérjék azonosítására (Hillenkamp – Karas, 1988). A módszer tulajdonképpen speciális porlasztásos ionizációs folyamat, amelyben a vizsgálandó anyagot speciális mátrix elemmel kristályosítanak ki (valamilyen szerves savval) és lézerrel sugározzák be. A mátrix, amelybe az analizálandó anyagot beágyazzák, kulcsszerepet játszik, ugyanis a sugárzást nagymértékben abszorbeálni képes, egyúttal mint proton donor és akceptor működik.

A kulcsfehérjék azonosítása funkcionális proteomikai eljárással 

A dinamikus fehérjeútvonalak szereplőinek azonosítása alapjában affinitási módszereken alapul. Az alapötlet, hogy a kérdéses fehérjét a sejtközegből úgy vonják ki, hogy a jelölt fehérje specifikus partnereit is egyben kinyerjék. A fehérje, amelynek segítségével a funkcionális fehérjehálózatot azonosíthatják, valamilyen hibrid – gyakran glutation-S-transzferázzal vagy más epitóppal (FLAG, HA, c-myc) fuzionált, esetleg poli-His (Hisztidin) farkat tartalmaz vagy biotinnal módosított. A célfehérjét (amellyel az dinamikus fehérjehálózatot azonosítják) agaróz gélben rögzítik és ún. ATL (anti-tag ligand) címkével (glutation, anti-epitóp antitest, Ni ionok, sztreptavidin) látják el. A célfehérje – a rendszerben előforduló kommunikációs hálózatban jelenlévő fehérjepartnerekkel kölcsönhatást létesít, míg a nem interaktív proteineket később kimossák. A fehérjerendszereket MALDI/MS technikával vagy fingerprint eljárással azonosítják. Ilyen módszerrel azonosították például a ZnF224 transzkripciós faktort, mely az egyik legnagyobb (82 kDa) méretű fehérjékkel rendelkező család (ún. Krüppel-szerű cink-ujj fehérjecsalád) az emberi aldoláz-A gén negatív szabályzó elemének promóter régiójához kötődik

Fehérjék azonosítása szekvencia-specifikus tömegspektrometriával 

A tandem tömegspektrométerek számos változata már képes átfogó fehérjevizsgálatra, melynek során a peptideket – mint ionokat – fragmentálni képes ún. ütközés indukált disszociáció (collision induced dissociation, CID) révén. Ennek lényege, hogy a fragmentációban az ionokat gázmolekulákkal vagy atomokkal (pl. Ar) ütköztetik, melynek végeredménye specifikus peptidionok keletkezése és a viszonylag gyengébb kötések felhasadása. Gyakran a CID és a hasonló spektrométerek más eljárásokkal kombinációban használatosak, így például az ESI-vel (electronspray ionisation). Az ESI-MS módszerrel képzett alacsony energiája CID spektrum jórészt magas minőségű feldolgozást ad, és szekvencia specifitása hatékony.

A peptid ionspektrum jellemzői 

Jellemző, hogy mindegyik tandem tömegspektrum tartalmaz b és y ionokat (az a,b,c fragmentált ionok N-terminálisú, az x, y, z peptid ionok C-terminálisúak). Ezeket ún. diagnosztikus jellegű komponensnek hívják, aminosav oldalláncaikról specifikus csoportok szakadnak le a folyamat során, amely egy-egy fehérjecsaládra ill. funkcióra jellemzőek. Az adott mintában megjelenhet például szén-monoxid, amely a típusú peptidion jelenlétére utalhat. Tapasztalati eredmények alapján tudjuk, hogy az aminosavláncok belső fragmentációi igen gyakran prolin vagy aszparaginsav jelenlétének következménye. Ez azt is mutatja, hogy a kötések között differenciálódások vannak kötéserősség tekintetében, legalább is alacsony energiájú CID spektrumokban.

Azok a peptidek, amelyek aszparaginsavat tartalmaznak hajlamosak a C-terminálissal szomszédos peptidkötés mellett hasadni. Ez az aszparaginsav azon tulajdonságának tudható be, hogy ilyen esetben átmeneti 6-szénatomos gyűrű képződhet az aszparaginsav karboxilsav oldallánca és a szomszédos peptidkötés között.

Mindezekből látható, hogy a peptid tömegspektrometria nagyban a szekvencia függvénye, elsőrendűen meghatározza az aminosav oldalláncok bázikussága, az oldalláncok felépítése és a töltöttségi állapot. Ha a fehérjét tegyük fel teljesen elemésztjük tripszinnel, mindegyik peptid C-terminálisán lizin vagy arginin fog helyet foglalni. Bizonyos okokból a fragmentált peptidionok ralatív intenzitása CID esetében megjósolhatatlan. Néhány alapelv ismertté vált a folyamatban, sok sajátosság azonban még nem telesen tisztázott.

De Novo peptidszekvencia vizsgálat

Alapvető kérdés volt a CID spektrumok esetében, hogy pontosan meg tudjuk mondani, melyik peptidion tartozik az ún. b-ionsorozathoz és melyik az y-hoz. Enélkül ugyanis szekvenálás nem teljes körű. Ennek megoldására több elképzelés is született. Ilyen többek közt a PLS (protein ladder sequencing) szekvenálás, melynek alapja, hogy a peptid fragmentumok molekulasúlyai szerinti differenciálást veszik alapul.

Elektroforetikus módszerek a proteomikában (összehasonlítás)

Analitikai módszer	Leggyakoribb proteomikai eljárás	Előnye	Korlátozottságok	Példák, alkalmazások
SDS-PAGE	Western blot, Tömegspektrometria (MS)	Könnyű használat, relatíve költségkímélő eljárás; membránfehérjék vizsgálatára is alkalmas; magas pH esetén használható	Korlátozott elválasztási hatékonyság	Nukleoporinokkal kölcsönható fehérjék detektálása (Saccharo- myces cerevisiae; NMDA receptor multiprotein-komplexek térbeli vizsgálata
2D-PAGE	Egyéb analitikai vizsgálatok megelőző eljárása	Jól kidolgozott vizsgálati módszer, sok hátránnyal; jó elválasztási hatékonyság, könnyen kombinálható az MS-el	Számos pontban manuális beavatkozást igényel; Magas sótartalmú mintákkal korlátozottan működik; LMW és HMW fehérjék esetén az érzékenysége alacsony	Általában tömegspektrometriai analízis megelőző lépéseként használatos; agaróz gél- elektroforézis; kromatofókuszálás;

Génexpressziós analízis

A proteomikai tömegspektrometria egy új ígéretes felhasználási területe nem csak a fehérjék azonosítását és mélyebb funkcionális szemléletét teszi lehetővé, hanem a génexpressziós folyamatoknak szintjeit is. Ilyen módszer, amikor kémiailag stabil, könnyen azonosítható izotópot adnak egy mintához (2H, 13C, 15N). A fehérjekeveréket (referencia minta) olyan mintával hasonlítják össze, amely ugyanazokat a fehérjéket tartalmazza, csak jelölten. Minthogy a két mintában a fehérjék gyakorlatilag azonosak, ugyanazokkal a tulajdonságokkal és sajátságokkal rendelkeznek az azonosítás (elválasztás, izolálás) során.

Chait és mts-ai élesztőgombákat neveltek két típusú táptalajon: az első normál mennyiségben tartalmazott 15N izotópot (99,6% 14N), míg a másik kultúrában ennek az arányát megnövelték (> 96%). Egy adott növekedési periódusban a kultúrákat összevegyítették, és a kérdéses fehérjét HPLC (high performance liquid cromatography) kromatográfiával kivonták, majd gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elválasztották. A beépült 15N izotópokat PMM (peptide mass mapping) technikával azonosították.

A kvantitatív fehérjeanalízis egyik újszerű megoldása az ICAT (izotóp kódolt affinitás jelölés), amely lehetővé teszi fehérjék eltérő mintákból történő párhuzamos azonosítását a cisztein aminosavnak oxidációra érzékeny tiol-csoportja révén. A módszer azon alapszik, hogy a reakcióközegbe jódacetát-jódacetamid keveréket adnak, s míg előbbi negatív töltést képes átvinni a peptidekre, utóbbi nem, ami a keletkezett diszulfid-hidak számát befolyásolja. Ha két komponens arányát változtatjuk, akkor ennek révén a képződött diszulfid-hidak száma megbecsülhető, amiből számos fukcionális és térszerkezeti sajátságra lehet következtetni. Kísérletben nyúlszív sejtekből kivont fehérjefrakcióban vizsgálták a ciszteinek mennyiségét és a térszerkezeti viszonyokat. Az eredmény során kiderült, hogy oxidációt szenvedett cisztein tiol-csoportok száma a vártnál alacsonyabb volt, a jelenlévő magas oxidáló közeg ellenére.

Festési eljárások gélelektroforézisben

Festés	Érzékenység (gr/fehérje)	Hatásfok	Vizualizáció	Költség	Előny	Hátrány
Ezüstimpregnáció	10-9	10 ×	Vizuális	Közepesen drága	Érzékenység, könnyű használat	Összetett, időigényes
Ragyogó kék (Coomassie Brilliant Blue)	10-8	10 ×	Vizuális	Kis költségű	Gyors, könnyű használat	Érzékenységi szint
CCS (CollidalCoomassie Staining)	10-8	10 ×	Vizuális	Közepesen drága	Gyors, könnyű használat	Érzékenységi szint
Fluoreszcens rendszerek	10-9	1 000 ×	Előhívással, Transzilluminátor	Drága	Jó reprodukálhatóság	Felszerelést igényel
Differenciál gélelektroforézis	10-5 - 10-9	10 000 ×	Xenonlámpa	Drága	Párhuzamosan vizsgálható minták ugyanabban a gélben	Izoelektromos fókuszálás esetén anomáliát okoz a mintában

Forrás

• Albenne, Cécile (2013). „Plant cell wall proteomics: the leadership of Arabidopsis thaliana”. Frontiers in Plant Science 4, Kiadó: Frontiers Media SA. DOI:10.3389/fpls.2013.00111. ISSN 1664-462X.  
• Roland Kellner: Proteomics, concepts and perspectives; (http://www.proteomic-basics.eu/2004/kellner_2.pdf)

Lásd még

Proteom