Kemotaxis assay
A kemotaxis assay-k prokarióta és eukarióta sejtek kemotaktikus képességének mérésére szolgáló eljárások. A technikák széles skálája ismert, melyeket e célra alkalmaznak. Egyesek segítségével a kísérletet végző csupán azt tudja meghatározni, hogy a vizsgált sejtekre vonzó vagy taszító hatással van egy kérdéses anyag (kvalitatív mérés), míg más technikák az adott kemotaktikus válaszok intenzitásának mértékéről részletesebb, számadatokban is kifejezhető értékeket szolgáltatnak (kvantitatív mérés).
Minőségi ellenőrzés
A vizsgálatok megkezdésekor a legáltalánosabb alapkövetelmény a kemotaxis assay optimális inkubációs idejének beállítása, mely az alkalmazott modell-sejttől, illetve a vizsgált anyagtól függően különböző lehet. A túlzottan rövid inkubációs idők a minták sejtszegénységét okozhatják, míg a kelleténél hosszabb inkubáció esetén a ligand által kialakított és a kemotaxis vizsgálatához szükséges koncentráció gradiens már nem áll fenn és a mérés inkább a kemokinetikus mint a kemotaktikus választ méri. A leggyakrabban alkalmazott technikák két nagy csoportba sorolhatók:
Agar-lemezes technikák
A mérésnek ez a formája agar-agart vagy gelatint tartalmazó zselés lemezeket alkalmaz, melyeket a kísérlet megkezdése előtt, frissen készítünk. A lemezekbe egymástól megadott távolságra kis üregeket vagy csatornákat fúrunk, melyeket a sejteket tartalmazó oldatokkal vagy a vizsgálni kívánt anyag különböző hígításaival töltünk meg. A lemezben, illetve az alatt a vizsgált anyag koncentráció gradiense alakul ki, mely a sejtek számára detektálható. A sejtek mind magában a zselés rétegben, mind a lemez alatt szabadon képesek elmozdulni a számukra kedvező kémiai inger irányába. A technika egyes változataiban üregek és egymással párhuzamosan futó csatornák találhatók, melyeket a kísérlet kezdetekor egy összekötő vágat készítésével hozunk kapcsolatba (ld. PP-technika). A PP technika sugár irányú elrendezése esetén (3 vagy több csatorna-pár) adott a lehetőség különböző sejt-populációk szinkron, összehasonlító elemzésére vagy egy sejtcsoportnál különböző típusú anyagok közötti preferencia mérésére is.[1]
Sejtszám meghatározása: e technikák esetében a pozitív választ mutató sejtek száma a vándorló sejtek által alkotott határvonalban festést követően vagy natív állapotban is meghatározható, kontollok ellenében kiértékelhető.
Két-kamrás technikák
Az adott pórusátmérőjű filterekkel elválasztott kamrák igen jó eszközei a sejtek pontos kemotaktikus aktivitás meghatározásának. E kamrák között a Boyden által készített kamra volt az első, több technikai problémát is kiküszöbölő eszköz.[2] Itt a sejtek egy felső rekeszbe kerülnek, míg a vizsgálandó anyag oldatát az ez alatt elhelyezett részbe töltjük. A migráló sejtek mérete határozza meg a két kamra közé helyezett filter pórusátmérőjét. Az in vivo állapot modellezése céljából több eljárás esetében az extracelluláris mátrix molekuláival (kollagén, elasztin stb.) fedik a filter sejtekkel érintkező felszínét. A mérések hatékonyságát növelte a sokkamrás (multiwell) rendszerek kifejlesztése (például NeuroProbe), ahol 24, 96, 384 minta értékelhető ki párhuzamosan. E változat nagy előnye, hogy bennük számos párhuzamos minta vizsgálható azonos körülmények között.
A kamrák egy másik elrendezésében azok horizontálisan, egymás mellett (például Zigmond kamra)[3] vagy mint egymást körülvevő gyűrűk (például Dunn kamra)[4] helyezkednek el. A koncentráció gradiens ezekben az esetekben a kamrákat összekötő keskeny híd-szerű képletek felszínén alakul ki, a migráló sejtek számát is e felszíneken határozzák meg fénymikroszkóppal. Egyes esetekben az összekötő hidak felszínét agarral fedik, így a migráló sejteknek ebben szöveti teret modellező, félig szilárd rétegen kell átfúrniuk magukat a vizsgálandó anyag irányába.
Egyes kapilláris technikák szintén a kamrákhoz hasonló elrendezést biztosítanak, bár azakben az esetekben nem található filter a sejtes és a vizsgálandó anyagot tartalmazó rész között.[5] E próbák is kvantitatív eredményeket adnak, amennyiben sokkamrás rendszereket állítunk be 4-8-12 csatornás mikropipetták alkalmazásával. A pipetták nagy pontossága és a párhuzamosan vizsgált minták számának növelése adja e technika nagy előnyét.[6]
Sejtszám meghatározása: a pozitív válaszadó sejtek számát az alsó kamrában (hosszú inkubációs idő) vagy magában a filterben (rövid inkubációs idő) határozhatjuk meg. A sejtek észlelésére általános festési eljárások (például tripán kék) vagy speciális próbák (például mt-dehidrogenáz aktivitás kimutatása MTT assay-vel) használtak. A sejtek jelölése (például fluorokrómokkal) is elfogadott technika, egyes próbákban a sejtek a filteren történő áthaladásuk során válnak jelzetté.
Mikro-video-rekording technika
Egyes csillósok (például Tetrahymena, Euplotes, Oxytricha) úszási mintázata (ethogram) jobbra és balra kanyarodó ívek, valamint egyenes vonalú úszási szakaszok váltakozásából épül fel. Ennek eredménye a sejt úszási irányát meghatározó mozgás-mintázatok random váltakozása az adott térben. A kialakuló mintázatok egyediségét a körívek egyes szakaszainak hossza, illetve iránya adja, míg e lépéssorok váltakozásának gátlása a sejtek körpályán való mozgását eredményezi.[7][8]
A sejtek fent leírt mozgási mintázatának vizsgálatára a leggyakrabban alkalmazott módszer a sejtek elmozdulásának sötétlátóteres, valós-idejű (real-time), digitalizált rögzítése (átlagos felbontóképesség 80 μm). A kapott információk kiegészítésére szabadon mozgó sejtek és egyes mozgási sejtszervecskéik (ld. csillók, ostorok) világos látóterű video-mikroszkópos analízise alkalmazható. Megbízható és egyben reprezentatív eredményt mintánként, illetve kísérleti csoportonként minimum 20, átlagosan 50 sejt úszásának kiértékelése ad.
Egyéb technikák
A fentiekben vázolt két, leggyakrabban alkalmazott technika-csoport mellett a kemotaxis mérésre alkalmas eljárások széles köre fejlődött ki. Egyesek csupán kvalitatív meghatározást adnak, ilyen a sejtek aggregációján alapuló teszt, amelyben egy kis, vizsgálati anyagot tartalmazó agar vagy filter darabkát helyezünk a tárgylemezre és az e körül felszaporodó sejtek akkumulációját értékeljük. Egy másik, szemikvantitatív módszerben a sejteket tartalmazó oldatot a vizsgálandó anyagra rétegezzük. majd annak sejt mentes részhez viszonyított opaleszcencia változását mérjük egy adott inkubációs idő alatt.[9] A harmadik, bár kvalitatív, de nagyon gyakran használt technika az ún. T-maze (maze = útvesztő ang.), valamint annak lemezes adaptációi. Az eredeti változatban egy olyan ’T’ alakú csövet használunk melyben a három cső találkozásánál egy furatban csiszolt csap található. A csapba fúrt lyuka sejtek befogadására szolgál. Ennek feltöltése után a csapot elforgatva a sejtek a másik két csőben elhelyezett anyagokkal kerülnek kapcsolatba. A kísérletet az inkubációs idő leteltével a csap elforgatásával fejezzük be, majd a sejtszámot az egyes mintákban meghatározzuk.[10]
Függelék
- ↑ Kőhidai L. (1995). „Method for determination of chemoattraction in Tetrahymena pyriformis.”. Curr Microbiol 30, 251-3. o.
- ↑ Boyden, S.V. (1962). „The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.”. J Exp Med 115, 453. o.
- ↑ Zigmond S.H. (1988). „Orientation chamber in chemotaxis.”. Methods Enzymol 162, 65-72. o.
- ↑ Zicha D., Dunn G.A., Brown A.F. (1991). „A new direct-viewing chemotaxis chamber.”. J Cell Sci 99, 769-75. o.
- ↑ Leick V.and Helle J. (1983). „A quantitative assay for ciliate chemotaxis.”. Anal Biochem 135, 466-9. o.
- ↑ Kőhidai, L., Lemberkovits, É. and Csaba, G. (1995). „Molecule dependent chemotactic responses of Tetrahymena pyriformis elicited by volatile oils.”. Acta Protozool 34, 181-5. o.
- ↑ Ricci, N. (1990). „The behaviour of ciliated protozoa.”. Anim Behav 40, 1048. o.
- ↑ Ricci, N., Luverà, G., Cacciatori, M., Banchetti, R., Lueken, W. (1997). „The effects of 2 µM Hg++ on the ethogram of Euplotes vannus (Ciliata, Hypotrichida)”. Europ J Protistol 33, 63. o.
- ↑ Koppelhus U., Hellung-Larsen P. and Leick V. (1994). „An improved quantitative assay for chemokinesis in Tetrahymena.”. Biol Bull 187, 8-15. o.
- ↑ Van Houten J., Martel E. and Kasch T. (1982). „Kinetic analysis of chemokinesis of Paramecium.”. J Protozool 29, 226-30. o.