Kemotaxis assay
A kemotaxis assay-k prokarióta és eukarióta sejtek kemotaktikus képességének mérésére szolgáló eljárások. A technikák széles skálája ismert, melyeket e célra alkalmaznak. Egyesek segítségével a kísérletet végző csupán azt tudja meghatározni, hogy a vizsgált sejtekre vonzó vagy taszító hatással van egy kérdéses anyag (kvalitatív mérés), míg más technikák az adott kemotaktikus válaszok intenzitásának mértékéről részletesebb, számadatokban is kifejezhető értékeket szolgáltatnak (kvantitatív mérés).
Tartalomjegyzék |
Minőségi ellenőrzés [szerkesztés]
A vizsgálatok megkezdésekor a legáltalánosabb alapkövetelmény a kemotaxis assay optimális inkubációs idejének beállítása, mely az alkalmazott modell-sejttől, illetve a vizsgált anyagtól függően különböző lehet. A túlzottan rövid inkubációs idők a minták sejtszegénységét okozhatják, míg a kelleténél hosszabb inkubáció esetén a ligand által kialakított és a kemotaxis vizsgálatához szükséges koncentráció gradiens már nem áll fenn és a mérés inkább a kemokinetikus mint a kemotaktikus választ méri. A leggyakrabban alkalmazott technikák két nagy csoportba sorolhatók:
Agar-lemezes technikák [szerkesztés]
A mérésnek ez a formája agar-agart vagy gelatint tartalmazó zselés lemezeket alkalmaz, melyeket a kísérlet megkezdése előtt, frissen készítünk. A lemezekbe egymástól megadott távolságra kis üregeket vagy csatornákat fúrunk, melyeket a sejteket tartalmazó oldatokkal vagy a vizsgálni kívánt anyag különböző hígításaival töltünk meg. A lemezben, illetve az alatt a vizsgált anyag koncentráció gradiense alakul ki, mely a sejtek számára detektálható. A sejtek mind magában a zselés rétegben, mind a lemez alatt szabadon képesek elmozdulni a számukra kedvező kémiai inger irányába. A technika egyes változataiban üregek és egymással párhuzamosan futó csatornák találhatók, melyeket a kísérlet kezdetekor egy összekötő vágat készítésével hozunk kapcsolatba (ld. PP-technika). A PP technika sugár irányú elrendezése esetén (3 vagy több csatorna-pár) adott a lehetőség különböző sejt-populációk szinkron, összehasonlító elemzésére vagy egy sejtcsoportnál különböző típusú anyagok közötti preferencia mérésére is.[1]
Sejtszám meghatározása: e technikák esetében a pozitív választ mutató sejtek száma a vándorló sejtek által alkotott határvonalban festést követően vagy natív állapotban is meghatározható, kontollok ellenében kiértékelhető.
Két-kamrás technikák [szerkesztés]
Az adott pórusátmérőjű filterekkel elválasztott kamrák igen jó eszközei a sejtek pontos kemotaktikus aktivitás meghatározásának. E kamrák között a Boyden által készített kamra volt az első, több technikai problémát is kiküszöbölő eszköz.[2] Itt a sejtek egy felső rekeszbe kerülnek, míg a vizsgálandó anyag oldatát az ez alatt elhelyezett részbe töltjük. A migráló sejtek mérete határozza meg a két kamra közé helyezett filter pórusátmérőjét. Az in vivo állapot modellezése céljából több eljárás esetében az extracelluláris mátrix molekuláival (kollagén, elasztin stb.) fedik a filter sejtekkel érintkező felszínét. A mérések hatékonyságát növelte a sokkamrás (multiwell) rendszerek kifejlesztése (például NeuroProbe), ahol 24, 96, 384 minta értékelhető ki párhuzamosan. E változat nagy előnye, hogy bennük számos párhuzamos minta vizsgálható azonos körülmények között. A kamrák egy másik elrendezésében azok horizontálisan, egymás mellett (például Zigmond kamra) [3] vagy mint egymást körülvevő gyűrűk (például Dunn kamra) [4] helyezkednek el. A koncentráció gradiens ezekben az esetekben a kamrákat összekötő keskeny híd-szerű képletek felszínén alakul ki, a migráló sejtek számát is e felszíneken határozzák meg fénymikroszkóppal. Egyes esetekben az összekötő hidak felszínét agarral fedik, így a migráló sejteknek ebben szöveti teret nmodellező, félig szilárd rétegen kell átfúrniuk magukat a vizsgálandó anyag irányába. Egyes kapilláris technikák szintén a kamrákhoz hasonló elrendezést biztosítanak, bár azakben az esetekben nem található filter a sejtes és a vizsgálandó anyagot tartalmazó rész között.[5] E próbák is kvantitatív eredményeket adnak, amennyiben sokkamrás rendszereket állítunk be 4-8-12 csatornás mikropipetták alkalmazásával. A pipetták nagy pontossága és a párhuzamosan vizsgált minták számának növelése adja e technika nagy előnyét.[6]
Sejtszám meghatározása: a pozitív válaszadó sejtek számát az alsó kamrában (hosszú inkubációs idő) vagy magában a filterben (rövid inkubációs idő) határozhatjuk meg. A sejtek észlelésére általános festési eljárások (például tripán kék) vagy speciális próbák (például mt-dehidrogenáz aktivitás kimutatása MTT assay-vel) használtak. A sejtek jelölése (például fluorokrómokkal) is elfogadott technika, egyes próbákban a sejtek a filteren történő áthaladásuk során válnak jelzetté.
Mikro-video-rekording technika [szerkesztés]
Egyes csillósok (például Tetrahymena, Euplotes, Oxytricha) úszási mintázata (ethogram) jobbra és balra kanyarodó ívek, valamint egyenes vonalú úszási szakaszok váltakozásából épül fel. Ennek eredménye a sejt úszási írányát meghatározó mozgás-mintázatok random váltakozása az adott térben. A kialakuló mintázatok egyediségét a körívek egyes szakaszainak hossza, illetve iránya adja, míg e lépéssorok váltakozásának gátlása a sejtek körpályán való mozgását eredményezi.[7][8]
A sejtek fent leírt mozgási mintázatának vizsgálatára a leggyakrabban alkalmazott módszer a sejtek elmozdulásának sötétlátóteres, valós-idejű (real-time), digitalizált rögzítése (átlagos felbontóképesség 80 μm). A kapott információk kiegészítésére szabadon mozgó sejtek és egyes mozgási sejtszervecskéik (ld. csillók, ostorok) világos látóterű video-mikorszkópos analízise alkalmazható. Megbízható és egyben reprezentatív eredményt mintánként, illetve kísérleti csoportonként minimum 20, átlagosan 50 sejt úszásának kiértékelése ad.
Egyéb technikák [szerkesztés]
A fentiekben vázolt két, leggyakrabban alkalmazott technika-csoport mellett a kemotaxis mérésre alkalmas eljárások széles köre fejlődött ki. Egyesek csupán kvalitatív meghatározást adnak, ilyen a sejtek aggregációján alapuló teszt, amelyben egy kis, vizsgálati anyagot tartalmazó agar vagy filter darabkát helyezünk a tárgylemezre és az e körül felszaporodó sejtek akkumulációját értékeljük. Egy másik, szemikvantitatív módszerben a sejteket tartalmazó oldatot a vizsgálandó anyagra rétegezzük. majd annak sejt mentes részhez viszonyított opaleszcencia változását mérjük egy adott inkubációs idő alatt.[9] A harmadik, bár kvalitatív, de nagyon gyakran használt technika az ú.n. T-maze (maze = útvesztő ang.), valamint annak lemezes adaptációi. Az eredeti változatban egy olyan ’T’ alakú csövet használunk melyben a három cső talalkozásánál egy furatban csiszolt csap található. A csapba fúrt lyuka sejtek befogadására szolgál. Ennek feltöltése után a csapot elforgatva a sejtek a másik két csőben elhelyezett anyagokkal kerülnek kapcsolatba. A kísérletet az inkubációs idő leteltével a csap elforgatásával fejezzük be, majd a sejtszámot az egyes mintákban meghatározzuk.[10]
Függelék [szerkesztés]
- ↑ Kőhidai L. (1995.). „Method for determination of chemoattraction in Tetrahymena pyriformis.”. Curr Microbiol 30, 251-3. o.
- ↑ Boyden, S.V. (1962.). „The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.”. J Exp Med 115, 453. o.
- ↑ Zigmond S.H. (1988.). „Orientation chamber in chemotaxis.”. Methods Enzymol 162, 65-72. o.
- ↑ Zicha D., Dunn G.A., Brown A.F. (1991.). „A new direct-viewing chemotaxis chamber.”. J Cell Sci 99, 769-75. o.
- ↑ Leick V.and Helle J. (1983.). „A quantitative assay for ciliate chemotaxis.”. Anal Biochem 135, 466-9. o.
- ↑ Kőhidai, L., Lemberkovits, É. and Csaba, G. (1995.). „Molecule dependent chemotactic responses of Tetrahymena pyriformis elicited by volatile oils.”. Acta Protozool 34, 181-5. o.
- ↑ Ricci, N. (1990.). „The behaviour of ciliated protozoa.”. Anim Behav 40, 1048. o.
- ↑ Ricci, N., Luverà, G., Cacciatori, M., Banchetti, R., Lueken, W. (1997.). „The effects of 2 µM Hg++ on the ethogram of Euplotes vannus (Ciliata, Hypotrichida)”. Europ J Protistol 33, 63. o.
- ↑ Koppelhus U., Hellung-Larsen P. and Leick V. (1994.). „An improved quantitative assay for chemokinesis in Tetrahymena.”. Biol Bull 187, 8-15. o.
- ↑ Van Houten J., Martel E. and Kasch T. (1982.). „Kinetic analysis of chemokinesis of Paramecium.”. J Protozool 29, 226-30. o.
