„Szerkezetszámolás” változatai közötti eltérés

Linkek hozzáadása
A Wikipédiából, a szabad enciklopédiából
Újabb szerkesztés →
Tartalom törölve Tartalom hozzáadva
VizuálisWikiszöveges
Edudas (vitalap | szerkesztései)
19 szerkesztés
Szerkesztések, hivatkozások és ábra
(Nincs különbség)

A lap 2018. június 12., 10:29-kori változata

A szerkezetszámolás az NMR alapú fehérje szerkezet-meghatározás egyik fontos lépése. 2002-ben Kurt Wüthrich Nobel-díjat kapott „olyan módszerek fejlesztéséért, melyek segítségünkre lehetnek a biológiai makromolekulák azonosításában és szerkezetük vizsgálatában”.

A fehérjék NMR-spektroszkópiával történő térszerkezet-vizsgálata mára már krisztallográfiai felbontás elérésére is képes. A PDB (Protein Data Bank) adatbázisban az NMR szerkezetek száma egyre nő (összesen 141010 szerkezet, ebből 126240 röntgenkrisztallográfiai módszerekkel meghatározott, 12225 pedig NMR spektroszkópiai megközelítéssel készült)[1]. A módszerek korlátját a fehérje molekulatömege jelenti. A szerkezetszámoláshoz kísérletileg meghatározott kényszerfeltételekre van szükség, ezeket több csoportba sorolhatjuk; leggyakrabban a távolsági és szög kényszerfeltételeket használják.

Távolsági kényszerfeltételek

Egy homonukleáris 2D NOESY spektrumban megjelenő keresztcsúcs két atommag térbeli közelségére utal, így minden csúcshoz tartozik egy maximális távolság az atommagok között, általában 1.8–6 A közötti érték. Egy NOESY csúcs intenzitása a távolság hatodik hatványával fordítottan arányos, ezért a távolság a csúcsintenzitás alapján meghatározható. Az intenzitás-távolság összefüggés nem pontos, így általában egy távolságtartományt használunk.

Kulcsfontosságú a NOESY jelek hozzárendelése a megfelelő atommaghoz a kémiai eltolódás alapján. Manuálisan végezve ez egy rendkívül munkaigényes feladat, mivel a fehérjék – méretüktől függően - több ezer NOESY jellel rendelkezhetnek. Néhány számítógépes program, mint például a PASD[2] [3]/XPLOR-NIH[4] [5], az UNIO[6], a CYANA[7], az ARIA[8]/CNS[9], és az AUDANA[10]/PONDEROSA-C/S[11] az Integrative NMR platformban[12] automatikusan elvégzi ezt a feladatot a manuálisan megadott csúcslisták alapján, szerkezetszámolással. Az iteratívan finomított csúcslistán alapuló fáradságos munka mellőzésével, direkt hozzáférést a NOESY adatokhoz eddig csak az  XPLOR-NIH –be [4] implementált PASD[2] algoritmus, az UNIO szoftvercsomagba[6] implementált  ATNOS/CANDID, valamint a PONDEROSA-C/S adott, és ezáltal objektív és hatékony NOESY spektrum analízist tettek lehetővé.

A hibalehetőségek száma átlapoló jelek esetében megnő, ezért a nagyobb méretű fehérjék esetében (> 50 aminosav) már izotóp jelöléssel érdemes próbálkozni. A 15N és 13C editált NOESY mérések segítenek a proton dimenzióban átfedő csúcsok azonosításában. Ez gyorsabb és megbízhatóbb asszignációt tesz lehetővé, ezáltal jobb szerkezetek számolhatók.

Szög kényszerfeltételek

A távolsági kényszerfeltételek mellett a kémiai kötések torziós szögeihez, tipikusan a ψ és φ szögekhez is megadhatók kényszerfeltételek. Az ehhez kapcsolódó módszerek azon a tényen alapulnak, hogy az α szénatom geometriája befolyásolja a csatolási állandókat és a kémiai eltolódásokat. Egy lehetséges megközelítés a Karplus-egyenlet használata, mellyel a 3JHH(NH-CH) három-kötéses csatolási állandókból kaphatók szög kényszerek.[13]

Egy másik megközelítés (TALOS+) szerint a kémiai eltolódásokból lehet ilyen kényszerfeltételeket meghatározni. [14]

Orientációs kényszerfeltételek

A vizsgálandó molekulák egy mintában részlegesen rendeződhetnek a külső mágneses térhez képest, ha változtatjuk a minta tulajdonságait. Ún. rendezett közegként széles körben alkalmazzák a bakteriofágokat vagy bicellákat, illetve a minta elkészítését egy nyújtott poliakrilamid gélben.[15] Ez olyan helyi környezetet teremt, mely nem gömbszerű molekulák bizonyos rendeződését segíti elő. Oldatfázisú NMR-ben az atommagok közötti dipoláris csatolások a molekulák bukdácsolása miatt kiátlagolódnak, ám az orientáció csekély populációtöbblete azt eredményezi, hogy maradék dipoláris csatolások (RDC) figyelhetők meg. Így információ nyerhető a kötésvektorok helyzetéről egy globális koordináta-rendszerben. Leggyakrabban az N-H vektor orientációját vizsgálják. Kísérleti úton az RDC értéke a 1H, 15N-HSQC spektrumokból határozható meg. Izotróp közegben az 1JNH értéke, rendezett közegben 1JNH+RDC értékét lehet megmérni. Kezdetben a maradék dipoláris csatolásokat a korábban meghatározott szerkezetek finomítására használták, de kísérletet tettek már csak RDC feltételeken alapuló de novo szerkezet-meghatározásra is.[16]

Szerkezetszámolás

Az NMR spektroszkópiás szerkezet-meghatározás szerkezetek sokaságát eredményezi. A szerkezetek csak akkor konvergálnak, ha az adatok megfelelnek egy specifikus feltekeredés kijelölésére. Ezekben a szerkezetekben ez csak a szerkezet egy részére igaz. PDB entry 1SSU.

A kísérletileg meghatározott kényszerfeltételek a szerkezetszámolási folyamat bemeneti információjaként használhatók. Az XPLOR-NIH[4], CYANA vagy GeNMR programokat használó kutatók arra törekednek, hogy minél több kényszer teljesüljön a fehérjék általános tulajdonságain kívül, mint pl. a kötéshosszak és –szögek. Az algoritmusok ezeket a kényszereket és az általános fehérjetulajdonságokat energiatagokká alakítják át, majd próbálják minimalizálni ezt az energiát. A folyamat eredményeként szerkezetek sokaságát kapjuk, amik konvergálnak, ha az adatok megfelelőek egy bizonyos szerkezet kijelölésére.

A szerkezet validálása

Fontos megjegyezni, hogy a kapott szerkezetsokaság egy „kísérleti modell”, azaz egy bizonyos fajtájú kísérleti adat ábrázolása. Ennek a ténynek az elismerése elengedhetetlen, mert azt jelenti, hogy a modell jó vagy rossz megjelenítése is lehet a kísérleti adatoknak.[17] Általában a modell minősége a kísérleti adatok minőségén és mennyiségén múlik, illetve ezen adatok megfelelő értelmezésén.

Fontos emlékeznünk arra is, hogy minden kísérlet hibákkal jár. Véletlenszerű hibák befolyásolják a szerkezetek reprodukálhatóságát és precizitását. A szisztematikus hibák a modell pontosságára vannak hatással. A pontosság a mérés reprodukálhatóságának mértékét jelenti, és gyakran az azonos körülmények között megismételt mérésből kapott adatkészlet eltérésével fejezik ki. A precizitás azt adja meg, milyen mértékben közelíti meg egy mérés a „valódi” értékét.

Egy fehérjemodell annál pontosabb, minél jobban illeszkedik a tényleges molekulához, amit megjelenít, és annál precízebb, minél kisebb az atomok helyzetének bizonytalansága. Gyakorlatban nincs olyan „standard molekula”, amihez a fehérjemodelleket hasonlítani lehetne, így a pontosságot a modell és a kísérleti adatok közötti egyezés mértékével jellemzik. Történetileg az NMR-rel meghatározott szerkezetek általában rosszabb minőségűek, mint a röntgenkrisztallográfiával meghatározottak. Ennek részben az az oka, hogy kevesebb adatot tartalmaznak. Emiatt elterjedtté vált az NMR szerkezeti sokaságok minőségének meghatározására, hogy összevetették ugyanazon fehérje röntgenszerkezetével. Ez azért jelenthet problémát, mert előfordulhat, hogy a röntgenszerkezet lehet nem létezik, és mivel a fehérjék oldatban flexibilis molekulák, egyetlen szerkezettel jellemezni egy fehérjét az egyes atomok belső változásainak alul-becsléséhez vezethet. Egy konformációkészlet NMR-rel vagy röntgenkrisztallográfiával meghatározva ezért jobb megjelenítése lehet egy fehérje kísérleti adatainak, mint egy konformáció. [18]

Egy modell felhasználhatóságát részben a modell pontosságának és precizitásának mértéke adja meg. Egy pontos modell rossz precizitással felhasználható fehérjék evolúciós kapcsolatainak tanulmányozásához, míg a gyógyszertervezéshez precíz és pontos modellek szükségesek. Egy modell, ami nem pontos, a precizitásától függetlenül nem lesz túl hasznos.[17][19]

Mivel a fehérjeszerkezetek kísérleti modellek hibákkal, nagyon fontos, hogy detektálni tudjuk ezeket a hibákat. Ez a folyamat a validálás. Számos módszer létezik validálásra, néhány statisztikus, mint a PROCHECK és a WHAT IF, míg mások fizikai szabályokon alapulnak, mint a CheShift, vagy e kettőnek keverékei, mint a PSVS.

  1. ↑ Bank, RCSB Protein Data. „RCSB PDB - Holdings Report” (angol nyelven).  
  2. ↑ a b Kuszewski, John, Daniel S. (2004. május 1.). „Completely Automated, Highly Error-Tolerant Macromolecular Structure Determination from Multidimensional Nuclear Overhauser Enhancement Spectra and Chemical Shift Assignments” (angol nyelven). Journal of the American Chemical Society 126 (20), 6258–6273. o. DOI:10.1021/ja049786h. ISSN 0002-7863.  
  3. ↑ Kuszewski, John J., G. Marius (2008. július 31.). „Automated error-tolerant macromolecular structure determination from multidimensional nuclear Overhauser enhancement spectra and chemical shift assignments: improved robustness and performance of the PASD algorithm” (angol nyelven). Journal of Biomolecular NMR 41 (4), 221–239. o. DOI:10.1007/s10858-008-9255-1. ISSN 0925-2738. PMID 18668206.  
  4. ↑ a b c (2003. január 1.) „The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package” (angol nyelven). Journal of Magnetic Resonance 160 (1), 65–73. o. DOI:10.1016/S1090-7807(02)00014-9. ISSN 1090-7807.  
  5. ↑ (2006. március 31.) „Using Xplor–NIH for NMR molecular structure determination” (angol nyelven). Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 48 (1), 47–62. o. DOI:10.1016/j.pnmrs.2005.10.001. ISSN 0079-6565.  
  6. ↑ a b Herrmann, Torsten (2010. március 15.). „Protein Structure Calculation and Automated NOE Restraints” (angol nyelven). Encyclopedia of Magnetic Resonance, Chichester, UK, Kiadó: John Wiley & Sons, Ltd. DOI:10.1002/9780470034590.emrstm1151.  
  7. ↑ Peter Güntert: Automated NMR Structure Calculation With CYANA. 2004. 353–378. o. ISBN 1592598099 Hozzáférés: 2018. június 12.  
  8. ↑ Rieping, W., B. (2006. november 22.). „ARIA2: Automated NOE assignment and data integration in NMR structure calculation” (angol nyelven). Bioinformatics 23 (3), 381–382. o. DOI:10.1093/bioinformatics/btl589. ISSN 1367-4803.  
  9. ↑ Brünger, A. T., G. M. (1998. szeptember 1.). „Crystallography & NMR System: A New Software Suite for Macromolecular Structure Determination” (angol nyelven). Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 54 (5), 905–921. o. DOI:10.1107/S0907444998003254. ISSN 0907-4449.  
  10. ↑ Lee, Woonghee, Gabriel (2016. május 12.). „The AUDANA algorithm for automated protein 3D structure determination from NMR NOE data” (angol nyelven). Journal of Biomolecular NMR 65 (2), 51–57. o. DOI:10.1007/s10858-016-0036-y. ISSN 0925-2738. PMID 27169728.  
  11. ↑ Lee, Woonghee, John L. (2014. szeptember 5.). „PONDEROSA-C/S: client–server based software package for automated protein 3D structure determination” (angol nyelven). Journal of Biomolecular NMR 60 (2-3), 73–75. o. DOI:10.1007/s10858-014-9855-x. ISSN 0925-2738. PMID 25190042.  
  12. ↑ Lee, Woonghee, Hesam (2016. március 29.). „Integrative NMR for biomolecular research” (angol nyelven). Journal of Biomolecular NMR 64 (4), 307–332. o. DOI:10.1007/s10858-016-0029-x. ISSN 0925-2738. PMID 27023095.  
  13. ↑ Parella, Teodor: Protein NMR. J(HN-HA) Coupling Constants. triton.iqfr.csic.es. (Hozzáférés: 2018. június 12.)
  14. ↑ TALOS+ Protein Backbone Dihedral Angle Prediction Program (amerikai angol nyelven). spin.niddk.nih.gov. (Hozzáférés: 2018. június 12.)
  15. ↑ Chen, Kang (2012. május 21.). „The Use of Residual Dipolar Coupling in Studying Proteins by NMR”. Topics in current chemistry 326, 47–67. o. DOI:10.1007/128_2011_215. ISSN 0340-1022. PMID 21952837.  
  16. ↑ Eva de Alba – Nico Tjandra: Residual Dipolar Couplings in Protein Structure Determination. 2004. 089–106. o. ISBN 1592598099 Hozzáférés: 2018. június 12.  
  17. ↑ a b Roman A. Laskowski: Structural Quality Assurance. 2005–01–28. 273–303. o. ISBN 9780471202004 Hozzáférés: 2018. június 12.  
  18. ↑ Arnautova, Yelena A., Osvaldo A. (2009. június 20.). „What can we learn by computing 13Cα chemical shifts for X-ray protein models?”. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 65 (Pt 7), 697–703. o. DOI:10.1107/S0907444909012086. ISSN 0907-4449. PMID 19564690.  
  19. ↑ (2004. december 17.) „Validation of protein structures derived by NMR spectroscopy” (angol nyelven). Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 45 (3-4), 315–337. o. DOI:10.1016/j.pnmrs.2004.08.003. ISSN 0079-6565.  
A lap eredeti címe: „https://hu.wikipedia.org/w/index.php?title=Szerkezetszámolás&oldid=20020144”