Ugrás a tartalomhoz

Szerkezetszámolás

Linkek hozzáadása
Ellenőrzött
A Wikipédiából, a szabad enciklopédiából

A szerkezetszámolás az NMR-alapú fehérjeszerkezet-meghatározás egyik fontos lépése. 2002-ben Kurt Wüthrich Kémiai Nobel-díjat kapott „olyan módszerek fejlesztéséért, melyek segítségünkre lehetnek a biológiai makromolekulák azonosításában és szerkezetük vizsgálatában”.

A fehérjék NMR-spektroszkópiával történő térszerkezet-vizsgálata mára már krisztallográfiai felbontás elérésére is képes. A PDB (Protein Data Bank) adatbázisban az NMR-szerkezetek száma egyre nő (összesen 141 010 szerkezet, ebből 126 240 röntgenkrisztallográfiai módszerekkel meghatározott, 12 225 pedig NMR-spektroszkópiai megközelítéssel készült).[1] A módszerek korlátját a fehérje molekulatömege jelenti. A szerkezetszámoláshoz kísérletileg meghatározott kényszerfeltételekre van szükség, ezeket több csoportba sorolhatjuk; leggyakrabban a távolsági és szög kényszerfeltételeket használják.

Távolsági kényszerfeltételek

[szerkesztés]

Egy homonukleáris 2D NOESY spektrumban megjelenő keresztcsúcs két atommag térbeli közelségére utal, így minden csúcshoz tartozik egy maximális távolság az atommagok között, általában 1,8–6 A közötti érték. Egy NOESY csúcs intenzitása a távolság hatodik hatványával fordítottan arányos, ezért a távolság a csúcsintenzitás alapján meghatározható. Az intenzitás-távolság összefüggés nem pontos, így általában egy távolságtartományt használunk.

Kulcsfontosságú a NOESY jelek hozzárendelése a megfelelő atommaghoz a kémiai eltolódás alapján. Manuálisan végezve ez egy rendkívül munkaigényes feladat, mivel a fehérjék – méretüktől függően - több ezer NOESY jellel rendelkezhetnek. Néhány számítógépes program, mint például a PASD,[2][3]/XPLOR-NIH[4][5] az UNIO,[6] a CYANA,[7] az ARIA[8]/CNS[9] és az AUDANA[10]/PONDEROSA-C/S[11] az integratív NMR-platformban[12] automatikusan elvégzi ezt a feladatot a manuálisan megadott csúcslisták alapján, szerkezetszámolással. Az iteratívan finomított csúcslistán alapuló fáradságos munka mellőzésével, direkt hozzáférést a NOESY adatokhoz eddig csak az  XPLOR-NIH –be[4] implementált PASD[2] algoritmus, az UNIO szoftvercsomagba[6] implementált  ATNOS/CANDID, valamint a PONDEROSA-C/S adott, és ezáltal objektív és hatékony NOESY spektrum analízist tettek lehetővé.

A hibalehetőségek száma átlapoló jelek esetében megnő, ezért a nagyobb méretű fehérjék esetében (> 50 aminosav) már izotópjelöléssel érdemes próbálkozni. A 15N és 13C editált NOESY mérések segítenek a proton dimenzióban átfedő csúcsok azonosításában. Ez gyorsabb és megbízhatóbb asszignációt tesz lehetővé, ezáltal jobb szerkezetek számolhatók.

Szög kényszerfeltételek

[szerkesztés]

A távolsági kényszerfeltételek mellett a kémiai kötések torziós szögeihez, tipikusan a ψ és φ szögekhez is megadhatók kényszerfeltételek. Az ehhez kapcsolódó módszerek azon a tényen alapulnak, hogy az α szénatom geometriája befolyásolja a csatolási állandókat és a kémiai eltolódásokat. Egy lehetséges megközelítés a Karplus-egyenlet használata, mellyel a 3JHH(NH-CH) háromkötéses csatolási állandókból kaphatók szögkényszerek.[13]

Egy másik megközelítés (TALOS+) szerint a kémiai eltolódásokból lehet ilyen kényszerfeltételeket meghatározni.[14]

Orientációs kényszerfeltételek

[szerkesztés]

A vizsgálandó molekulák egy mintában részlegesen rendeződhetnek a külső mágneses térhez képest, ha változtatjuk a minta tulajdonságait. Ún. rendezett közegként széles körben alkalmazzák a bakteriofágokat vagy bicellákat, illetve a minta elkészítését egy nyújtott poliakrilamid gélben.[15] Ez olyan helyi környezetet teremt, mely nem gömbszerű molekulák bizonyos rendeződését segíti elő. Oldatfázisú NMR-ben az atommagok közötti dipoláris csatolások a molekulák bukdácsolása miatt kiátlagolódnak, ám az orientáció csekély populációtöbblete azt eredményezi, hogy maradék dipoláris csatolások (RDC) figyelhetők meg; ezáltal egy adott globális koordináta-rendszerben információ nyerhető a kötésvektorok helyzetéről. A gyakorlatban leginkább az N-H vektor orientációjának vizsgálata terjedt el. Ebben az esetben az RDC értékek az izotróp és rendezett közegben felvett 1H, 15N-HSQC spektrumokból határozhatók meg. Izotróp közegben 1JNH, rendezett közegben 1JNH+RDC csatolások értéke mérhető, ezek különbsége adja meg a vizsgálandó paramétert. Az RDC paraméter értékeket korábban a már meghatározott szerkezetek finomítására használták, de kísérletet tettek kizárólag RDC feltételeken alapuló de novo szerkezet-meghatározásra is.[16]

Szerkezetszámolás

[szerkesztés]
Az NMR-spektroszkópiás szerkezet-meghatározás szerkezetek sokaságát eredményezi. A szerkezetek csak akkor konvergálnak, ha az adatok megfelelnek egy specifikus feltekeredés kijelölésére. Ezekben a szerkezetekben ez csak a szerkezet egy részére igaz. PDB entry 1SSU

A kísérletileg meghatározott kényszerfeltételek a szerkezetszámolási folyamat bemeneti információjaként használhatók. Az XPLOR-NIH,[4] CYANA vagy GeNMR programokat használó kutatók arra törekednek, hogy az eddig felsoroltak közül minél több kényszerfeltétel teljesüljön. Az algoritmusok ezeket a kényszerfeltételeket és az általános fehérjetulajdonságokat energiatagokká alakítják át, majd próbálják minimalizálni ezt az energiát. A folyamat eredményeként szerkezetek sokaságát kapjuk, amik konvergálnak, ha az adatok megfelelőek egy bizonyos szerkezet kijelölésére.

A szerkezet validálása

[szerkesztés]

Fontos megjegyezni, hogy a kapott szerkezetsokaság egy „kísérleti modell”, azaz egy bizonyos fajtájú kísérleti adat ábrázolása. Ennek a ténynek az elismerése elengedhetetlen, mert azt jelenti, hogy a modell jó vagy rossz megjelenítése is lehet a kísérleti adatoknak.[17] Általában a modell minősége a kísérleti adatok minőségén és mennyiségén múlik, illetve ezen adatok megfelelő értelmezésén.

Fontos emlékeznünk arra is, hogy minden kísérlet hibákkal jár. Véletlenszerű hibák befolyásolják a szerkezetek reprodukálhatóságát és precizitását. A szisztematikus hibák a modell pontosságára vannak hatással. A precizitás a mérés reprodukálhatóságának mértékét jelenti, és gyakran az azonos körülmények között megismételt mérésből kapott adatkészlet eltérésével fejezik ki. A pontosság azt adja meg, milyen mértékben közelíti meg egy mérés a „valódi” értékét.

Egy fehérjemodell annál pontosabb, minél jobban illeszkedik a tényleges molekulához, amit megjelenít, és annál precízebb, minél kisebb az atomok helyzetének bizonytalansága. Gyakorlatban nincs olyan „standard molekula”, amihez a fehérjemodelleket hasonlítani lehetne, így a pontosságot a modell és a kísérleti adatok közötti egyezés mértékével jellemzik. Történetileg az NMR-spektroszkópia segítségével meghatározott szerkezetek általában rosszabb minőségűek, mint a röntgenkrisztallográfiával meghatározottak. Ennek részben az az oka, hogy kevesebb adatot tartalmaznak. Emiatt elterjedtté vált az NMR-szerkezeti sokaságok minőségének meghatározására, hogy összevetették ugyanazon fehérje röntgenszerkezetével. Ez azért jelenthet problémát, mert előfordulhat, hogy a röntgenszerkezet nem áll rendelkezésre, és mivel a fehérjék oldatban flexibilis molekulák, egyetlen szerkezettel jellemezni egy fehérjét az egyes atomok belső változásainak alul-becsléséhez vezethet. Egy konformációkészlet NMR-spektroszkópia segítségével vagy röntgenkrisztallográfiával meghatározva ezért jobb megjelenítése lehet egy fehérje kísérleti adatainak, mint egy konformáció.[18]

Egy modell felhasználhatóságát részben a modell pontosságának és precizitásának mértéke adja meg. Egy pontos modell rossz precizitással felhasználható fehérjék evolúciós kapcsolatainak tanulmányozásához, míg a gyógyszertervezéshez precíz és pontos modellek szükségesek. Egy modell, ami nem pontos, a precizitásától függetlenül nem lesz túl hasznos.[17][19]

Mivel a fehérjeszerkezetek kísérleti modellek hibákkal, nagyon fontos, hogy detektálni tudjuk ezeket a hibákat. Ez a folyamat a validálás. Számos módszer létezik validálásra, néhány statisztikus, mint a PROCHECK és a WHAT IF, míg mások fizikai szabályokon alapulnak, mint a CheShift, vagy e kettőnek keverékei, mint a PSVS.

Jegyzetek

[szerkesztés]
  1. ↑ Bank, RCSB Protein Data. „RCSB PDB - Holdings Report” (angol nyelven). [2007. július 4-i dátummal az eredetiből archiválva]. (Hozzáférés: 2018. június 12.) 
  2. ↑ a b Kuszewski, John, Daniel S. (2004. május 1.). „Completely Automated, Highly Error-Tolerant Macromolecular Structure Determination from Multidimensional Nuclear Overhauser Enhancement Spectra and Chemical Shift Assignments” (angol nyelven). Journal of the American Chemical Society 126 (20), 6258–6273. o. DOI:10.1021/ja049786h. ISSN 0002-7863. 
  3. ↑ Kuszewski, John J., G. Marius (2008. július 31.). „Automated error-tolerant macromolecular structure determination from multidimensional nuclear Overhauser enhancement spectra and chemical shift assignments: improved robustness and performance of the PASD algorithm” (angol nyelven). Journal of Biomolecular NMR 41 (4), 221–239. o. DOI:10.1007/s10858-008-9255-1. ISSN 0925-2738. PMID 18668206. 
  4. ↑ a b c (2003. január 1.) „The Xplor-NIH NMR molecular structure determination package” (angol nyelven). Journal of Magnetic Resonance 160 (1), 65–73. o. DOI:10.1016/S1090-7807(02)00014-9. ISSN 1090-7807. 
  5. ↑ (2006. március 31.) „Using Xplor–NIH for NMR molecular structure determination” (angol nyelven). Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 48 (1), 47–62. o. DOI:10.1016/j.pnmrs.2005.10.001. ISSN 0079-6565. 
  6. ↑ a b Herrmann, Torsten (2010. március 15.). „Protein Structure Calculation and Automated NOE Restraints” (angol nyelven). Encyclopedia of Magnetic Resonance, Chichester, UK, Kiadó: John Wiley & Sons, Ltd. DOI:10.1002/9780470034590.emrstm1151. 
  7. ↑ Peter Güntert: Automated NMR Structure Calculation With CYANA. 2004. 353–378. o. ISBN 1592598099 Hozzáférés: 2018. június 12.  
  8. ↑ Rieping, W., B. (2006. november 22.). „ARIA2: Automated NOE assignment and data integration in NMR structure calculation” (angol nyelven). Bioinformatics 23 (3), 381–382. o. DOI:10.1093/bioinformatics/btl589. ISSN 1367-4803. 
  9. ↑ Brünger, A. T., G. M. (1998. szeptember 1.). „Crystallography & NMR System: A New Software Suite for Macromolecular Structure Determination” (angol nyelven). Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 54 (5), 905–921. o. DOI:10.1107/S0907444998003254. ISSN 0907-4449. 
  10. ↑ Lee, Woonghee, Gabriel (2016. május 12.). „The AUDANA algorithm for automated protein 3D structure determination from NMR NOE data” (angol nyelven). Journal of Biomolecular NMR 65 (2), 51–57. o. DOI:10.1007/s10858-016-0036-y. ISSN 0925-2738. PMID 27169728. 
  11. ↑ Lee, Woonghee, John L. (2014. szeptember 5.). „PONDEROSA-C/S: client–server based software package for automated protein 3D structure determination” (angol nyelven). Journal of Biomolecular NMR 60 (2-3), 73–75. o. DOI:10.1007/s10858-014-9855-x. ISSN 0925-2738. PMID 25190042. 
  12. ↑ Lee, Woonghee, Hesam (2016. március 29.). „Integrative NMR for biomolecular research” (angol nyelven). Journal of Biomolecular NMR 64 (4), 307–332. o. DOI:10.1007/s10858-016-0029-x. ISSN 0925-2738. PMID 27023095. 
  13. ↑ Parella, Teodor: Protein NMR. J(HN-HA) Coupling Constants. triton.iqfr.csic.es. [2018. július 13-i dátummal az eredetiből archiválva]. (Hozzáférés: 2018. június 12.)
  14. ↑ TALOS+ Protein Backbone Dihedral Angle Prediction Program (amerikai angol nyelven). spin.niddk.nih.gov. (Hozzáférés: 2018. június 12.)
  15. ↑ Chen, Kang (2012. november 7.). „The Use of Residual Dipolar Coupling in Studying Proteins by NMR”. Topics in current chemistry 326, 47–67. o. DOI:10.1007/128_2011_215. ISSN 0340-1022. PMID 21952837. 
  16. ↑ Eva de Alba – Nico Tjandra: Residual Dipolar Couplings in Protein Structure Determination. 2004. 089–106. o. ISBN 1592598099 Hozzáférés: 2018. június 12.  
  17. ↑ a b Roman A. Laskowski: Structural Quality Assurance. 2005–01–28. 273–303. o. ISBN 9780471202004 Hozzáférés: 2018. június 12.  
  18. ↑ Arnautova, Yelena A., Osvaldo A. (2009. június 20.). „What can we learn by computing 13Cα chemical shifts for X-ray protein models?”. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 65 (Pt 7), 697–703. o. DOI:10.1107/S0907444909012086. ISSN 0907-4449. PMID 19564690. 
  19. ↑ (2004. december 17.) „Validation of protein structures derived by NMR spectroscopy” (angol nyelven). Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 45 (3-4), 315–337. o. DOI:10.1016/j.pnmrs.2004.08.003. ISSN 0079-6565. 
A lap eredeti címe: „https://hu.wikipedia.org/w/index.php?title=Szerkezetszámolás&oldid=26473938”