Vibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási teszt

A biolumineszcencia-gátlási teszt, egy fajt alkalmazó, bakteriális, akut toxicitási teszt, amely toxikus szennyező anyag hatására bekövetkező biolumineszcencia gátláson alapul. Elvégzéséhez az ún. ToxAlert^R 100 készüléket alkalmazzák. Bár elsősorban szennyvíz minőségének vizsgálatára dolgozták ki (a ToxAlert kompatibilis az ISO/EN/DIN 11348 szabvánnyal), sikeresen alkalmazták szennyezett talajok illetve üledékek toxicitásának értékelésére is.

Biolumineszcencia

luciferin

A biolumineszcencia az őt tartalmazó sejt életképességének jellemzője. Az élő rendszer általi lumineszcens fénykibocsátást szolgálja. Keltésében két enzim játszik szerepet. Az egyik a photogenáz, amely fehérjevegyületekből a luciferin nevű, a világító szervekben vagy szervezetekben finoman eloszlott anyagot termeli. A luciferin oxigén jelenlétében egy oxidáz molekula, amely luciferáz hatására oxiluciferinné oxidálódik, s közben fényt bocsát ki magából. Az oxiluciferin anyilyen könnyen oxidálódott, ugyanolyan könnyen redukálható is luciferinné a luciferin oxidációjakor az összes kisugárzott energia $92\%$-ban fényenergia alakjában hagyja el a fénykeltő szervet.

A bakteriális lumineszcens fény képzésének alapegyenlete a következő (Steinberg és munkatársai, 1995).

$\mathrm {FMNH_{2}+O_{2}+RCHO}$ →luciferáz→ $\mathrm {FMN+ROOH+H_{2}O}$ + fény

ahol $\mathrm {FMNH_{2}}$ a redukált, míg a $\mathrm {FMN}$ az oxidált luciferin mononukleotid.

A mérgező anyag változásokat idéz elő a sejt állapotában – sejtfal, sejtmembrán, az elektrontranszport-rendszer, enzimek, a citoplazma alkotói – amelyek a biolumineszcencia csökkenésében mutatkoztak meg.

Tesztorganizmusok

kurtafarkú tintahal

Sokféle organizmus (gerincesek, gerinctelenek, baktériumok) képes lumineszcens fényt kibocsátani. A természetben fellelhető lumineszcens baktériumok a Photobacterium nemzetség tagjai. Ezen baktériumok használata gyors, egyértelmű és költségkímélő. A leggyakrabban használt tesztorganizmus a Vibrio fischeri, ami egy olyan tengeri baktérium, amely a természetben a kurtafarkú tintahal speciális fény kibocsátó szervében, az úgy nevezett „fényszervben” él és optimális körülmények között, anyagcseréje során fényt bocsát ki.

További fontos szempont, hogy a baktériumok teszt szervezetként való használata nem okoz etikai problémákat. Ez igen fontos, hiszen az Európai Unió vegyi anyagokkal kapcsolatos stratégiája (White Paper, European Commission, 2001) explicite kimondja, hogy az állatokkal végzett tesztek számát csökkenteni kell.

A mérés lefolyása

luminométer

A mérés elvégzéséhez először a baktérium szuszpenziót kell elkészíteni, fagyasztva szárított baktérium és a tesztekhez szintén a Merck által forgalmazott rekonstrukciós oldat felhasználásával. A toxikus szennyező anyagot tartalmazó tömény mintából $1:2:4:8:16$ hígítási sort készítünk, sztenderd víz felhasználásával. Ehhez a hígítási sorhoz adjuk hozzá a baktérium szuszpenziót, majd az így kapott elegyek lumineszcencia gátlásának mértékét luminométerrel végezzük el. Az expozíciós időt 5 és 30 perc között állíthatjuk be. A kapott értékeket hasonlítjuk össze az előzőleg megmért a baktériumszuszpenzió lumineszcencia intenzitásának mértékével.

Mivel a Vibrio fischerivel tengeri baktérium, ezért a kísérletek végrehajtásakor a vizes oldat 2-3%-os $\mathrm {NaCl}$ koncentrációjának fenntartása, az ozmózisnyomás érdekében szükséges. Azonban $\mathrm {NaCl}$ hatására megnövekedett ionerősség befolyásolja a fémek kémiai formáját, és ezáltal a toxicitását. $\mathrm {Cl^{-}}$-ion jelenlétében a fémek kloro-komplex formává alakulnak, megváltoztatva ezzel az eredeti formának megfelelő toxicitást. Ezért az ozmózis nyomás fenntartása érdekében számos egyéb oldatot kipróbáltak: pl. fruktózt, D-glükózt, maltózt, glicerint, citromsavat, $\mathrm {NaNO_{3}}$, $\mathrm {(NH_{4})_{2}SO_{4}}$, $\mathrm {NaClO_{4}}$, $\mathrm {Na_{2}SO_{4}}$ stb., amelyek közül a $\mathrm {NaClO_{4}}$ és a $\mathrm {Na_{2}SO_{4}}$ vegyületeket találták a legmegfelelőbbnek. A $\mathrm {Na^{+}}$-ion jelenléte a mérés során feltétlenül szükséges, mivel a lumineszcencia intenzitása így alig változik. Ezért azok az ozmotikumok, amelyek nem tartalmaznak $\mathrm {Na^{+}}$-t, nem alkalmasak a $\mathrm {NaCl}$ helyettesítésére.

A mérést követő számítások

Az $f_{kt}$ korrekciós faktor:

$f_{kt}={l_{kt} \over l_{0}}$

ahol:

$f_{kt}$: az expozíciós (kontakt) időre meghatározott koncentrációs faktor

$l_{kt}$: lumineszcencia intenzitás a kontrollban, RLU-ban (relative luminescence units) mérve, az expozíciós idő után

$l_{0}$: a kontroll tesztszuszpenzió lumineszcencia intenzitása közvetlenül a hígító 2%-os $\mathrm {NaCl}$ oldat hozzáadása előtt.

A tesztmintára $l_{ct}$ értéke:

$l_{ct}=l_{0}\cdot f_{kt}$

ahol:

$f_{kt}$: az $f_{kt}$ átlaga

$l_{0}$: a kontroll tesztszuszpenzió lumineszcencia intenzitása közvetlenül a hígító (2%-os $\mathrm {NaCl}$) oldat hozzáadása előtt

$l_{ct}$: az $l_{0}$ korrigált értéke a tesztmintákra közvetlenül a tesztminta hozzáadása előtt.

A tesztminta $H_{t}$ inhibeáló effektusa:

$H_{t}={l_{ct}-l_{Tt} \over l_{ct}}\cdot 100$

ahol:

$H_{t}$: a tesztminta inhibeáló effektusa az expozíciós idő után, %-ban megadva

$l_{ct}$: az $l_{0}$ korrigált értéke a tesztmintákra közvetlenül a tesztminta hozzáadása előtt

$l_{Tt}$: a tesztminta lumineszcencia intenzitása az expozíciós idő után.

A teszt értékelése

Toxikusnak a $20\%$ feletti gátlást okozó mintákat tekintjük. A toxicitás számszerűsítése a legelterjedtebb mutatószám a halálos vagy halált okozó koncentráció, a concentratio letalis ($LC$). Technikai okok miadt leggyakrabban a közepes halálos koncentráció ($LC_{50}$) meghatározása történik. Az $LC_{50}$ kiszámítására az erre alkalmas szoftvert alkalmazzuk.

Források

• Bacillus fischeri (Beijerinck 1889) Trevisan 1889
• Bacterium phosphorescens indigenus (Eisenberg 1891) Chester 1897
• Einheimischer Leuchtbacillus Fischer 1888
• Microspira fischeri (Beijerinck 1889) Chester 1901
• Vibrio noctiluca Weisglass and Skreb 1963
• Molnár Mónika és Gruiz Katalin: Interaktív Környezettoxikológiai Tesztek Talajra (2007)
• Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem: Ökotoxikológiai vizsgálatok Vibrio fischeri tesztorganizmussal