Restrikciós endonukleáz

A Wikipédiából, a szabad enciklopédiából
Az EcoRV szerkezete és illeszkedése a DNS kettős szálához

A restrikciós endonukláz (vagy restrikciós enzim) olyan enzim, amely képes felismerni egy rövid nukleotidszekvenciát a kétszálú DNS-en belül és azon a helyen – vagy a közelében – elvágja a DNS-t[1]. Ezeket az enzimeket baktériumok és archebaktériumok termelik és a vírusfertőzés elleni védekezésben játszanak szerepet[2]. A sejten belül azokat az idegen nukleinsavakat vágják el, melyekben az általuk felismert szekvencián egy metiláz enzim korábban nem helyezett el egy metilcsoportot (és ezáltal korlátozzák, restrikció alá helyezik a vírusszaporodást). A két folyamat együtt alkotja a restrikciós modifikációs rendszert.

Eddig több mint 3000 restrikciós endonukleázt tanulmányoztak részletesen és közülük mintegy 600 kereskedelmi forgalomba is került[3]. A molekuláris biológiai laboratóriumok gyakran használják ezeket az enzimeket, többek között a klónozás és a génsebészet alapvető eszközei.

Felfedezése[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

Az 1950-es évek elején fedezte fel Salvador Luria és Giuseppe Bertani, hogy a λ-fág egyes Escherichia coli törzsekben jól szaporodik, míg másokban sokkal kevésbé[4]. Bizonyos törzsek képesek voltak csökkenteni a vírus fertőzőképességét, amely más törzsekbe való átvitel után is megmaradt. Az 1960-as években Werner Arber és Matthew Meselson kimutatta, hogy a restrikciós hatás a fág DNS-ének feldarabolása miatt következik be és az ezt végző enzimet restrikciós endonukláznak (a nukleinsav közepén vágó enzimnek) nevezték el[5]. Ezek az endonuklázok az I-es típushoz tartoztak, amelyek a felismerőhely közelében random módon vágják el a DNS-t. 1970-ben Hamilton O. Smith, Thomas Kelly és Kent Welcox felfedezte az első II-es típusú enzimet, a Haemophilus influenzae HindII fehérjéjét, amely a felismerőhelyen belül vágott[6]. Daniel Nathans mutatta ki, hogy a restrikciós endonukleázok specifikus darabokra vágják az SV40 (simian virus 40) DNS-ét, amiket aztán gélelektroforézissel szét lehet választani[7]. A módszerrel el lehetett kezdeni a vírusgenom feltérképezését. Werner Arber, Daniel Nathans, és Hamilton O. Smith 1978-ban orvosi Nobel-díjat kapott a restrikciós enzimekkel végzett munkájukért.

A felismerőhely[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A restrikciós endonukleázok egy bizonyos rövid nukleotidmintázatot ismernek fel a DNS-en belül. A felismerőhely általában 4-8 nukleotid hosszúságú és sok esetben palindrom, vagyis a bázisok sorrendje ugyanaz előre és visszafelé olvasva is. A palindrom szakasz lehet tükörszerű, amikor ugyanazon a szálon lehet visszafelé is elolvasni a szekvenciát (például GTAATG). Gyakoribb azonban, hogy az ismétlődés megfordított, vagyis a komplementer DNS-szálon lehet olvasni fordított irányban (például GTATAC, a bázispárosodásnak megfelelően a komplementer szálon visszafelé olvasva szintén GTATAC lesz).

Egyes endonukleázok „tompa” végű fragmenteket produkálnak, mint például a SmaI:

SmaI restriction enzyme recognition site.svg




A laboratóriumok inkább olyan enzimeket használnak amelyek „ragadós” végű darabokat produkálnak, mint az EcoRI:

EcoRI restriction enzyme recognition site.svg




Melegítés hatására a szálak szétválaszthatók és utána egy másik, ugyanilyen enzimmel elvágott DNS-el összehibridizálhatóak. Az elvágott szálak pedig a DNS-ligáz enzim segítségével összeforraszthatóak.

Azokat a restrikciós endonuklázokat, amelyeknek ugyanaz a felismerőhelyük neoskizomereknek nevezik. Azokat pedig, amelyeknek a hasítóhelyük is megegyezik, izoskizomernek.

A restrikciós endonukleázok elnevezése a következő szabály szerint áll össze: első betűje annak a baktérium genusának első betűje, amelyikből izolálták; utána a fajnév első két betűje; a törzs – ha van – első betűje, és végül egy sorszám. Az EcoRI például az Escherichia coli RY13 törzséből elsőként izolált enzim[8].

Típusok[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A baktériumokban előforduló restrikciós endonukleázokat négy csoportba (I, II III, és IV) sorolják, szerkezetük, kofaktorigényük, felismerőhelyük és hasítóhelyük alapján[9]:

  • I. típus, a felismerőhelyen kívül vágja a DNS-t; működéséhez ATP-re és S-adenozil-L-metioninra van szüksége; hasító és metiláló funkcióval is rendelkezik.
  • II. típus, a felismerőhelyen belül vagy hozzá nagyon közel vág; magnéziumionra van szüksége, metilázfunkcióval nem rendelkezik.
  • III. típus, a felismerőhely közelében vág; szüksége van ATP-re (de nem hidrolizálja el); az S-adenozil-L-metionin stimulálja a reakciót, de nem feltétlenül szükséges; egy komplexben van a metilázzal.
  • IV. típus, módosított (vagyis metilált, hidroximetilált vagy glükozil-hodroximetilált) DNS-t vág.

Mesterséges restrikciós enzimek[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A természetes enzimek szerkezetének kutatása lehetővé tette mesterséges endonukleázok létrehozását. Ilyenkor egy DNS-kötő domént egy nukleázdoménnel (például a FokI hasítódoménját) kombinálnak össze[10]. Az ilyen enzimek specificitása tetszés szerint módosítható, akár 36 bázispár hosszú szekvenciát is felismerhetnek.

Felhasználás[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A ragadós véget produkáló restrikciós enzimeket különböző eredetű DNS-szálak egymáshoz illesztésére lehet felhasználni, így főleg a génklónozási (nem összetévesztendő a teljes szervezet klónozásával) és génsebészeti kísérletekben. Erre a célra speciális plazmidvektorokat fejlesztettek ki, melyeken több, gyakran használt enzim felismerőhelye is megtalálható. Mind a plazmidot, mind az átvivendő DNS-szakaszt restrikciós enzimmel kezelik, összekeverés után felmelegítéssel elválasztják egymástól a szálakat, majd visszahűtés után (miután a kétszálú DNS-konformáció helyreállt) ligáz enzimmel összekötik az endonukleáz által elvágott szálat[11].

A restrikciós endonukleázok egyes pontmutációk gyors és olcsó felismerésére is alkalmasak, amennyiben a mutáció elront egy felismerőhelyet (vagy létrehozza azt). Ilyenkor az endonukleázos emésztés után az eredeti szakasz a gélelektroforézis során két rövidebb, míg a mutáns verzió egyetlen, hosszabb csíkot fog mutatni[12].

Restrikciós endonukleázokat használnak a törvényszéki orvostan által is alkalmazott DNS-ujjlenyomat meghatározásánál is. Az egyes hasítóhelyek közötti távolság egyénenként eltérő lehet, ami két minta közötti azonosság vagy akár rokonság gyors meghatározását teszi lehetővé.

A molekuláris biológia korai időszakában, amikor még nem álltak rendelkezésre olcsó szekvenálási módszerek, a restrikciós enzimeket a kisebb (főleg vírus-) genomok feltérképezésére is használták.

Példák[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

Az alábbi táblázatban néhány restrikciós enzim, felismerő- és hasítóhelyük látható[13]:

Enzim Eredet Felismerőhely Hasítóhely
EcoRI Escherichia coli
5'GAATTC
3'CTTAAG
5'---G     AATTC---3'
3'---CTTAA     G---5'
EcoRII Escherichia coli
5'CCWGG
3'GGWCC
5'---     CCWGG---3'
3'---GGWCC     ---5'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens
5'GGATCC
3'CCTAGG
5'---G     GATCC---3'
3'---CCTAG     G---5'
HindIII Haemophilus influenzae
5'AAGCTT
3'TTCGAA
5'---A     AGCTT---3'
3'---TTCGA     A---5'
TaqI Thermus aquaticus
5'TCGA
3'AGCT
5'---T   CGA---3'
3'---AGC   T---5'
NotI Nocardia otitidis
5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG
5'---GC   GGCCGC---3'
3'---CGCCGG   CG---5'
HinfI Haemophilus influenzae
5'GANTCA
3'CTNAGT
5'---G   ANTC---3'
3'---CTNA   G---5'
Sau3A Staphylococcus aureus
5'GATC
3'CTAG
5'---     GATC---3'
3'---CTAG     ---5'
PvuII* Proteus vulgaris
5'CAGCTG
3'GTCGAC
5'---CAG  CTG---3'
3'---GTC  GAC---5'
SmaI* Serratia marcescens
5'CCCGGG
3'GGGCCC
5'---CCC  GGG---3'
3'---GGG  CCC---5'
HaeIII* Haemophilus aegyptius
5'GGCC
3'CCGG
5'---GG  CC---3'
3'---CC  GG---5'
HgaI[14] Haemophilus gallinarum
5'GACGC
3'CTGCG
5'---NN  NN---3'
3'---NN  NN---5'
AluI* Arthrobacter luteus
5'AGCT
3'TCGA
5'---AG  CT---3'
3'---TC  GA---5'
EcoRV* Escherichia coli
5'GATATC
3'CTATAG
5'---GAT  ATC---3'
3'---CTA  TAG---5'
EcoP15I Escherichia coli
5'CAGCAGN25NN
3'GTCGTCN25NN
5'---CAGCAGN25   NN---3'
3'---GTCGTCN25NN   ---5'
KpnI[15] Klebsiella pneumoniae
5'GGTACC
3'CCATGG
5'---GGTAC  C---3'
3'---C  CATGG---5'
PstI[15] Providencia stuartii
5'CTGCAG
3'GACGTC
5'---CTGCA  G---3'
3'---G  ACGTC---5'
SacI[15] Streptomyces achromogenes
5'GAGCTC
3'CTCGAG
5'---GAGCT  C---3'
3'---C  TCGAG---5'
SalI[15] Streptomyces albus
5'GTCGAC
3'CAGCTG
5'---G  TCGAC---3'
3'---CAGCT  G---5'
ScaI*[15] Streptomyces caespitosus
5'AGTACT
3'TCATGA
5'---AGT  ACT---3'
3'---TCA  TGA---5'
SpeI Sphaerotilus natans
5'ACTAGT
3'TGATCA
5'---A  CTAGT---3'
3'---TGATC  A---5'
SphI[15] Streptomyces phaeochromogenes
5'GCATGC
3'CGTACG
5'---GCATG  C---3'
3'---C  GTACG---5'
StuI*[16][17] Streptomyces tubercidicus
5'AGGCCT
3'TCCGGA
5'---AGG  CCT---3'
3'---TCC  GGA---5'
XbaI[15] Xanthomonas badrii
5'TCTAGA
3'AGATCT
5'---T  CTAGA---3'
3'---AGATC  T---5'

Kódok:
* = tompa vég
N = bármilyen, C,G,T vagy A nukleotid
W = A vagy T

Források[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

  1. Roberts RJ (November 1976). "Restriction endonucleases". CRC Crit. Rev. Biochem. 4 (2): 123–64.
  2. Arber W, Linn S (1969). "DNA modification and restriction". Annu. Rev. Biochem. 38: 467–500
  3. Roberts RJ, Vincze T, Posfai J, Macelis D. (2007). "REBASE—enzymes and genes for DNA restriction and modification". Nucleic Acids Res 35 (Database issue): D269–70.
  4. Luria SE, Human ML (October 1952). "A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses". J. Bacteriol. 64 (4): 557–69.
  5. Meselson M, Yuan R (March 1968). "DNA restriction enzyme from E. coli". Nature 217 (5134): 1110–4.
  6. Smith HO, Wilcox KW (July 1970). "A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties". J. Mol. Biol. 51 (2): 379–91.
  7. Danna K, Nathans D (December 1971). "Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 68 (12): 2913–7.
  8. Smith HO, Nathans D (December 1973). "Letter: A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes". J. Mol. Biol. 81 (3): 419–23.
  9. Bickle TA, Krüger DH (June 1993). "Biology of DNA restriction". Microbiol. Rev. 57 (2): 434–50.
  10. Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S (February 1996). "Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (3): 1156–60.
  11. Geerlof A. "Cloning using restriction enzymes". European Molecular Biology Laboratory - Hamburg.
  12. Wolff JN, Gemmell NJ (February 2008). "Combining allele-specific fluorescent probes and restriction assay in real-time PCR to achieve SNP scoring beyond allele ratios of 1:1000". BioTechniques 44 (2): 193–4, 196, 199.
  13. Roberts RJ (January 1980). "Restriction and modification enzymes and their recognition sequences". Nucleic Acids Res. 8 (1): r63–r80.
  14. Roberts RJ (1988.). „Restriction enzymes and their isoschizomers”. Nucleic Acids Res. 16 Suppl, r271–313. o. DOI:10.1093/nar/16.suppl.r271. PMID 2835753.  
  15. ^ a b c d e f g Krieger M, Scott MP, Matsudaira PT, Lodish HF, Darnell JE, Zipursky L, Kaiser C, Berk A. Molecular Cell Biology, 5th, New York: W.H. Freeman and Company (2004). ISBN 0-7167-4366-3 
  16. Stu I from Streptomyces tubercidicus. Sigma-Aldrich. (Hozzáférés: 2008. június 7.)
  17. Shimotsu H, Takahashi H, Saito H (1980. November). „A new site-specific endonuclease StuI from Streptomyces tubercidicus”. Gene 11 (3–4), 219–25. o. DOI:10.1016/0378-1119(80)90062-1. PMID 6260571.  

Ez a szócikk részben vagy egészben a Restriction enzyme című angol Wikipédia-szócikk ezen változatának fordításán alapul. Az eredeti cikk szerkesztőit annak laptörténete sorolja fel.