Polimeráz-láncreakció

A Wikipédiából, a szabad enciklopédiából
(PCR szócikkből átirányítva)

A polimeráz-láncreakció (szokásos rövidítése PCR, amely az angol polymerase chain reaction (IPA: [pəˈlɪməˌreɪz ˈˌtʃeɪn riˈækʃən]) elnevezésből származik) egy molekuláris biológiai technológia DNS enzimatikus amplifikálására (azaz a kópiák megsokszorozására) élő szervezet, például E. coli vagy élesztő, igénybevétele nélkül. A technológia lehetővé teszi a DNS egy kis darabjának megsokszorozását analízis céljából. A PCR általánosan használt módszer az élettudományi kutatásokban és egészségügyi laboratóriumokban a legkülönfélébb feladatokra, például örökletes betegségek kimutatása, genetikai ujjlenyomat azonosítása, fertőző betegségek diagnosztikája, gének klónozása és apasági vizsgálatok elvégzésére.

PCR a gyakorlatban[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

1. ábra: PCR-készülék

A PCR-t a DNS-szál egy rövid, jól definiált szakaszának amplifikálására használják. Ez lehet egyetlen gén vagy csak egy génrészlet. Az élő szervezetekkel ellentétben a PCR-folyamat csak kis DNS-szakaszok másolására képes, ezek hossza általában legfeljebb 10 kbp (kbp = kilobázispár = 1000 bázispár). Bizonyos módszerek akár 40 kbp méretű szakaszokat is képesek lemásolni, de még ez is elenyésző egy eukarióta sejt kromoszomális DNS-ének méretéhez képest – például egy emberi sejt kb. hárommilliárd bázispárt tartalmaz.

A PCR jelenleg alkalmazott formájában több alapvető komponenst igényel. Ezek a komponensek:

  • DNS-templát – ez tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját
  • Két primer – amely meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét (a primerekről lásd a következő szakaszt)
  • DNS-polimeráz – amely lemásolja az amplifikálandó szakaszt
  • Nukleotidok – amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t
  • Puffer – amely biztosítja a DNS-polimeráz számára megfelelő kémiai környezetet

A PCR-reakció a PCR-készülékben zajlik le. A készülék a reakciócsöveket ciklikusan felhevíti és lehűti a precízen megállapított hőmérsékletekre, amelyek a reakció egyes lépéseihez szükségesek. A reakcióelegy párolgását megakadályozandó, egy fűtött fedél kerül a reakciócsövek tetejére, vagy egy olajréteget helyeznek a reakcióelegy felszínére. A PCR-készülék ára nagyjából félmillió forint (2004-es ár).

Primerek[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

Az amplifikálandó DNS-szakaszt a primerek kiválasztásával határozzák meg. A primerek rövid, mesterséges DNS-szálak – 50 nukleotidnál (általában 18-25 bp) kevesebb alkotja őket – amelyek komplementerek az amplifikálandó DNS-szakasz elejével és végével. Hozzákapcsolódnak a DNS-templáthoz ezeken a kezdő- és végpontokon, ahová a DNS-polimeráz kötődik, és megkezdi egy új DNS-szál szintetizálását.

A primerek hosszának és olvadási hőmérsékletének (Tm) kiválasztásakor több dolgot is meg kell fontolni. A primer olvadási hőmérséklete – nem keverendő össze a DNS olvadási hőmérsékletével a PCR-folyamat első lépésében – definíció szerint az a hőmérséklet, amelynél a primer kötőhelyeinek fele foglalt. Az olvadási hőmérséklet nő a primer hosszával. A túl rövid primerek több helyre is kapcsolódhatnának egy hosszú DNS-templáton, amely nem specifikus kópiákat eredményezne. Másfelől a primer hossza limitált az olvadási hőmérséklet által. A túl magas olvadási hőmérsékletek, például 80 °C felett, azért jelentenek gondot, mert a DNS-polimeráz kevésbé aktív magas hőmérsékleten. A primer optimális hossza általában 20-40 nukleotid, 60 °C és 75 °C közötti olvadási hőmérséklettel.

Néha degenerált primereket használnak. Ezek tulajdonképpen hasonló, de nem azonos primerek keverékei. Akkor lehet kényelmes a használatuk, ha ugyanazt a gént különböző organizmusokból kell amplifikálni, ugyanis a gének maguk is valószínűleg hasonlóak, de nem azonosak. A degenerált primerek másik alkalmazási területe az, amikor a primer tervezésénél a proteinszekvenciát veszik figyelembe. Mivel több különböző kodon kódolhatja ugyanazt az aminosavat, gyakran nehéz kikövetkeztetni, hogy melyik kodon volt használva az adott esetben. Ezért például az izoleucin aminosav primerszekvenciája ATH lehet, ahol A az adenin, T a timin és H az adenin, timin vagy citozin. A degenerált primerek nagyban csökkentik a PCR-amplifikálás specificitását. Ezt a problémát részben megoldja a touchdown PCR.

A fent említett megfontolások miatt a primerek tervezése nagyon aprólékos folyamat, és az eredmény ezen múlik:

  • A GC-tartalom 40-60% között legyen.
  • A reakcióban használt mindkét primer számított Tm-jének különbsége 5 °C alatt legyen, és az amplifikált termék Tm-je ne különbözzön 10 °C-nál nagyobb mértékben a primerekétől.
  • A kapcsolódási (annealing) hőmérséklete általában −5 °C a számított alsó Tm alatt. Mindazonáltal ezt kísérleti úton kell meghatározni az adott környezethez.
  • A >4 belső, önmagával komplementer „hajtűk” és a >8 dimerek kerülendők.
  • A 3' terminus különösen érzékeny – nem lehet komplementer a reakcióban használt másik primer egyik régiójával sem, és a templáthoz tökéletesen illeszkezdő bázissorrenddel kell rendelkeznie.

Léteznek primertervező programok, (lásd Külső hivatkozások).

Az eljárás[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A PCR-eljárás húsz-harminc ciklus egymásutánjából áll. Mindegyik ciklus három lépést tartalmaz (2. ábra).

(1) A kettős szálú DNS-t 94-96 °C-ra hevítik, hogy a szálak szétváljanak. Ebben a denaturálásnak hívott lépésben a két DNS-szálat összekötő hidrogénkötések felbomlanak. Az első ciklus előtt a DNS-t gyakran hosszabb ideig denaturálják, hogy a templát DNS és a primerek kettős szálai is teljesen szeparálódjanak. Idő: 1-2 perc.

(2) A DNS-szálak szeparálása után a hőmérsékletet csökkentik, úgyhogy a primerek hozzá tudnak kapcsolódni a DNS-szálakhoz. Ezt a lépést annealing vagy kapcsolódási lépésnek nevezik. A hőmérséklet ebben a fázisban függ a primerektől, és általában 5 °C-kal van a primerek olvadási hőmérséklete alatt (45-60 °C). Ha a kapcsolódási lépésben a hőmérséklet nem megfelelő, a primerek vagy egyáltalán nem kötődnek a templáthoz, vagy véletlenszerűen kötődnek. Idő: 1-2 perc.

(3) Végül a DNS-polimeráz létrehozza a hiányzó szálat. A munkát a kapcsolódott primernél kezdi, és végigmegy a DNS-szálon. A lépés neve meghosszabbítás, ami szintetizálás alatt álló nukleinsavszál meghosszabbítására utal. A szintetizálás során a szülő nukleinsavszál szolgál templátként a leány lánc szintetizálásához. A meghosszabbítás hőmérséklete a DNS-polimeráztól függ. A lépés időigénye egyrészt függ magától a DNS-polimeráztól, másrészt az amplifikálandó DNS-szakasz hosszától. Ökölszabályként a percenként 1000 bázispár sebesség alkalmazható.

2. ábra: A PCR-ciklus sematikus ábrája. (1) Denaturálás 96 °C-on. (2) Kapcsolódás 68 °C-on. (3) Meghosszabbítás 72 °C-on (P=polimeráz). (4) Az első ciklus véget ért. Az eredményül kapott két DNS-szál a következő ciklus templátja lesz, azaz minden ciklusban megkétszereződik a DNS mennyisége.

Példa[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

Az ebben a példában szereplő hőmérséklet- és időértékek egy olyan PCR-programból származnak, amelyet sikerrel alkalmaztak az IGF (insulin-like growth factor) gén C-terminusán elhelyezkedő 250 bp hosszú szakaszának amplifikálására.

A reakciókeverék tartalma:

  • 1,0 µl DNS-templát (100 ng/µl)
  • 2,5 µl primer, 1,25 µl primerenként (100 ng/µl)
  • 1,0 µl Pfu polimeráz
  • 1,0 µl nukleotid
  • 5,0 µl puffer
  • 89,5 µl H2O

A 100 µl keveréket tartalmazó 200 µl-es reakciócsövet a PCR-készülékbe helyezték.

A PCR-eljárás a következő lépésekből áll:

1. lépés
Inicializáció. Hevítsük a keveréket 96 °C-on 5 percig, hogy a DNS-szálak és a primerek egyaránt megolvadjanak. A DNS-polimeráz jelen lehet az inicializáció idején, de e lépés után is hozzáadhatjuk.
2. lépés
Olvasztás. Hevítsük 96 °C-on 30 másodpercig. Ennyi idő általában minden ciklusban elegendő ahhoz, hogy a DNS denaturálódjon.
3. lépés
Kapcsolódás. Hevítsük 68 °C-on 30 másodpercig.
4. lépés
Meghosszabbítás. Hevítsük 72 °C-on 45 másodpercig.
5. lépés
A 2-4. lépéseket ismételjük meg 25-ször, de jó primerekkel és friss polimerázzal 15-20 ciklus is elegendő.
6. lépés
Tartsuk a keveréket 7 °C-on. Ez hasznos akkor, ha este kezdjük el a PCR-t, a munkaidő végén, így az éjjel lefuthat. A DNS 7 °C-on sérülés nélkül kibír egy éjszakát.
3. ábra: A PCR-termék összehasonlítva a DNS-létrával agargélen. A DNS-létra (1. sáv), a PCR-termék alacsony koncentrációban (2. sáv) és magas koncentrációban (3. sáv). A kép publikálására engedélyt adott: Helmut W. Klein, Biokémiai Intézet, Kölni Egyetem, Németország

A PCR-termék a mérete alapján azonosítható agargél-elektroforézis használatával. Az agargél-elektroforézis eljárása a következő: DNS-t injektálnak agargélbe, és elektromos áramot vezetnek át a gélen. Ennek hatására a kisebb DNS-szálak gyorsabban mozognak a gélben a pozitív sarok felé, mint a nagyobbak. A PCR-termék mérete egy, szintén a gélbe injektált, ismert hosszúságú DNS-szakaszokat tartalmazó DNS-létrával összehasonlítva határozható meg (3. ábra).

A PCR helyes kivitelezése[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A PCR nagyon érzékeny, ezért meg kell tenni a megfelelő óvintézkedéseket, hogy elkerüljük a szennyeződést, amelyet a laboratóriumi környezetben előforduló más DNS (baktériumból, vírusból vagy a vizsgáló személyből származó) okozhat. A DNS-minták előkészítése, a reakcióelegy összeállítása és a PCR-eljárás elvégzése az azt követő végtermék-elemzéssel elkülönített területeken végzendő el. A reakcióelegy elkészítéséhez ajánlatos lamináris áramlású fülke. Minden PCR-lépéshez új, eldobható kesztyűt kell venni, a pipettázáshoz aeroszolbarrieres pipettákat kell használni.

A PCR-hez használt reagenseket külön kell elkészíteni, és csak erre a célra szabad használni. A kimért mintákat elkülönítve kell tárolni az egyéb DNS-mintáktól. A kontrollreakciót (belső kontroll) – a templát DNS kihagyásával – mindig el kell végezni, hogy a szennyeződés hiánya megerősítést nyerjen.

A PCR alkalmazásai[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A PCR sokféle kísérlet és elemzés elvégzéséhez alkalmas eszköz. Következzék néhány példa.

Genetikai ujjlenyomat[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

Az igazságügyi orvosszakértői munkában hasznosítható a genetikai ujjlenyomat technikája, mely során a gyanúsított személyt úgy azonosítják, hogy a DNS-ét a bűncselekmény helyszínéről származó minta DNS-ével hasonlítják össze. Nem szükséges, hogy a minta (vér, ondó, nyál, haj stb.) sok DNS-t tartalmazzon, elméletileg egyetlen DNS-szál is elegendő. A DNS-t először szakaszokra bontják, majd PCR-rel amplifikálják. Az amplifikált szakaszokat gélelektroforézis segítségével szeparálják. A DNS-szakaszok elrendeződése adja ki a DNS-ujjlenyomatot. Mivel van (csekély) valószínűsége annak, hogy két személy ugyanazzal a szekvenciával rendelkezzék, a technika inkább a bűnösség kizárására alkalmas, mint a bizonyítására. Az egyezés mindazonáltal erősen valószínűsíti a bűnösséget.

Örökletes betegségek kimutatása[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

Az örökletes betegségek kimutatása egy adott genomban hosszú és bonyolult folyamat. A PCR használatával ez a folyamat lerövidíthető. A kérdéses gének PCR-rel könnyen amplifikálhatók a megfelelő primerek használatával, majd utána szekvenálhatók a mutáció kimutatása érdekében.

Fertőző betegségek kimutatása[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

Egyes vírusok és baktériumok által okozott fertőzések is kimutathatók a PCR-technika segítségével úgy, hogy a betegből származó mintából (például vérplazma) a fertőzést okozó mikroorganizmus DNS-ét amplifikálják. Ez a vizsgálat közvetlenül a fertőzés után elvégezhető, amely napokkal, esetleg hónapokkal a tünetek megjelenése előtt lehetővé teszi a diagnózis felállítását és a kezelés megkezdését. A mikroorganizmusok ellen termelődött antitestek kimutatásán alapuló immunodiagnosztikai vizsgálatokkal szemben a PCR lehetővé teszi a fertőzés kimutatását akkor is, ha az immunválasz valamiért elmarad, illetőleg nem ad álpozitív eredményt a múltban lezajlott fertőzések következtében.

Ősi DNS elemzése[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A PCR használatával lehetséges több ezer éves DNS vizsgálata is. Sikerrel alkalmazták a PCR-technikát ősállatokon, például egy negyvenezer éves mamuton, de emberi DNS-en is, többek között egyiptomi múmiák és az orosz cár azonosítására.

Történet[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A PCR-t Kary Mullis találta fel, mikor a Cetus Corp. alkalmazásában állt, 1983 decemberében. Eredményéért 1993-ban megkapta a kémiai Nobel-díjat, alig hét évvel azután, hogy javaslatát a gyakorlatba átültette. Mullis ötlete az volt, hogy olyan eljárást kellene kifejleszteni, amely a DNS-t mesterségesen megsokszorozza a DNS-polimeráz enzim segítségével, megismételt duplikációs ciklusok által.

A DNS-polimeráz megtalálható az élő szervezetekben, és funkciója a DNS lemásolása a sejt osztódásakor. A polimeráz a DNS egyik szálához kötődve létrehozza a komplementer szálat. Mullis eredeti eljárásában az enzim in vitro (azaz élő szervezeten kívül, kontrollált környezetben) működött. A kettős szálú DNS-t két szálra választotta szét úgy, hogy 96 °C-ra hevítette. Ezen a hőmérsékleten viszont az ez időben használt DNS-polimeráz lebomlott, úgyhogy az enzimet minden ciklusban pótolni kellett a hevítési lépés után. Mullis eredeti eljárása nagyon nem volt hatékony, mivel rengeteg időt igényelt, hatalmas mennyiségű DNS-polimerázt fogyasztott, és az egész eljárást folyamatosan figyelni kellett.

Később ezt az eredeti PCR-eljárást nagymértékben továbbfejlesztették, ugyanis elkezdték a 110 °C feletti hőmérsékletű gejzírekben élő, hőkedvelő baktériumok DNS-polimerázát használni. Ezeknek az organizmusoknak a DNS-polimeráza magas hőmérsékleten is stabil, és a PCR-eljárás alatt nem bomlik le a hevítési lépésben, amikor a DNS-szálak szétválnak. Ettől fogva nem volt szükséges új DNS-polimerázt hozzáadni minden ciklusban, így az adott DNS-szál másolásának eljárása leegyszerűsödött és automatizálhatóvá vált.

Az egyik első hőstabil DNS-polimerázt a Thermus aquaticus organizmusból nyerték, és a "Taq" nevet adták neki. A Taq polimeráz széles körben használt a jelenlegi PCR-gyakorlatban. A Taq hátránya, hogy időnként hibázik a DNS másolásakor, és ez mutációhoz (hibához) vezet a DNS-szekvenciában. Az ok az, hogy a Taq nem rendelkezik a 3'→5' hibajavító exonukleáz aktivitással. Az Archaea organizmusból nyert Pwo vagy a Pfu nevű polimerázok rendelkeznek a hibajavítás képességével, és ez szignifikánsan lecsökkenti a másolt DNS-szekvenciák mutációs rátáját. Sajnos azonban ezek az enzimek sokkal lassabbak, mint a Taq. Ma már elérhető a Taq és a Pfu kombinációja, amely egyszerre biztosítja a gyors polimerizációt és a pontos duplikációt.

Harc a szabadalmakért[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A PCR-technikát eredetileg Mullis akkori munkahelye, a Cetus Corporation szabadalmaztatta. A Taq polimerázenzimet szintén szabadalom védi. Több nagy per is volt a technikával kapcsolatban, a legnagyobb port a DuPont-per verte fel. A Hoffmann-La Roche gyógyszergyártó vállalat 1992-ben megvásárolta a szabadalmak jogait, és azóta is birtokolja.

Külső hivatkozások[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

Commons
A Wikimédia Commons tartalmaz Polimeráz-láncreakció témájú médiaállományokat.

Irodalom[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

  • Molecular cloning [A lab manual] Sambrook and Russell, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001.
  • Mullis, Kary, Dancing in the Minefield, ISBN 0-679-77400-9.