DNS–DNS-hibridizáció

A Wikipédiából, a szabad enciklopédiából

A DNS–DNS-hibridizáció arra a molekuláris biológiai technikára utal, ami két DNS-szekvencia közötti hasonlóság mértékét határozza meg. Általában két faj genetikai távolságának meghatározására használják. Ha több fajt hasonlítanak így össze, a hasonlósági értékek felhasználásával lehetővé válik a leszármazási fa felállítása; így ez a molekuláris rendszertan művelésének egyik módszere.

Charles Sibley és Jon Ahlquist, a módszer úttörői a főemlősök és a madarak (Sibley–Ahlquist-féle madárrendszertan) leszármazási kapcsolatainak felderítésére használták fel azt.[1][2]

A technikát kritizálók azzal érvelnek, hogy a módszer a közeli rokonságban lévő fajok viszonyainak megállapításában pontatlan eredményeket ad, mivel az ortológ[3] szekvenciák közötti távolságok mérését nagyon megnehezíti az élőlény genomjában tömegesen előforduló paralóg szekvenciák hibridizációja.[4]

Mára a DNS-szekvenálás és a szekvenciák számítógépes összehasonlítása az általánosan használt módszer a genetikai távolság mérésére, bár a hibridizációt a mikrobiológiában ma is alkalmazzák baktériumok azonosítására.[5]

A módszer leírása[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

A Sibley és Ahlquist által alkalmazott módszer során összehasonlítják az adott (címkézett) minta önmagával alkotott, illetőleg egy másik fajba tartozó DNS-ével alkotott hibridjeinek olvadáspontját.[6] A módszer kihasználja, hogy a dezoxiribonukleinsav (DNS)-molekula két szálát gyengén összekötő hidrogénhidak már enyhe melegítésre felbomlanak (ekkora a DNS-szálak belső szerkezete még nem sérül). Lehűléskor pedig a szimpla szálak között újra kialakulnak a hidrogénhidak, ha a két szál szekvenciái egymást éppen kiegészítik.

A folyamat a következőképpen zajlik le. Az összehasonlítandó fajok DNS-ét először kivonják, majd megtisztítják. Eztán a DNS-t rövid szakaszokra tördelik. Ezeknek a fragmentumoknak az elegyét felforralják, majd 50 °C-ra hűtik, ahol az ismétlődő szekvenciák már hibridizálnak, de az scnDNA (egypéldányos kódoló szakasz) nagyobbrészt egyszálú marad. Ezután az oldatot hidroxiapatit-oszlopon vezetik keresztül, ami csak a kettős szálú DNS-t (azaz ezen a ponton a repetitív szekvenciákat) köti meg. Az oszlopról lejövő egyes szálakat megjelölik (radioaktív izotópot (32P, 3H, 14C) vagy kovalens kötéssel színreakciót biztosító molekulatöredéket, esetleg specifikus ellenanyaggal detektálható csoportot építve a nukleinsavba), majd nagy mennyiségű jelöletlen DNS-t adnak hozzá. Ez utóbbi származhat a mintával megegyező fajból, vagy egy másik fajból. Néhány napig 60 °C-on tartják a keveréket, ez alatt a hasonló szekvenciájú szálak hibridizálódnak. A jelöletlen szálak óriási feleslege miatt a hibrid molekulák vagy teljesen jelöletlenek, vagy az egyik szálukon jelölt, a másikon jelöletlenek lesznek. A mintát ezután újra hidroxiapatit oszlopra viszik fel. Az oszlopot vízfürdőben melegítik 2,5 °C-onként a 60-90 °C-os hőmérsékleti tartományon belül. Minden emelés után lemossák az oszlopról a denaturált DNS-szálakat, azok mennyiségét a hőmérséklet függvényében ábrázolják. A kapott függvény a termikus elúciós profil, amely statisztikai elemzések kiindulópontja.

Egy gyakran alkalmazott eljárás szerint az elúciós profilból kiszámítják azt a hőmérsékleti értéket, amelyen a duplex DNS molekulák fele különválik (Tm = „olvadási hőmérséklet”). Az ugyanabból a fajból származó (homoduplex) DNS molekulák és a hibridizált molekulák (heteroduplex) olvadási hőmérsékletének különbsége, a ΔTm jellemzi a hasonlóság mértékét.

Irodalom[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

  • Graur, D. & Li, W-H. 1991 (2nd ed. 1999). Fundamentals of Molecular Evolution.

Források[szerkesztés | forrásszöveg szerkesztése]

Ez a szócikk részben vagy egészben a DNA-DNA hybridization című angol Wikipédia-szócikk ezen változatának fordításán alapul. Az eredeti cikk szerkesztőit annak laptörténete sorolja fel.

  1. Genetic Similarities: Wilson, Sarich, Sibley, and Ahlquist
  2. C.G. Sibley and J.E. Ahlquist (1984.). „The Phylogeny of the Hominoid Primates, as Indicated by DNA-DNA Hybridization”. Journal of Molecular Evolution 20, 2–15. o. DOI:10.1007/BF02101980.  
  3. Az „ortológ” és „paralóg” kifejezések meghatározása itt megtalálható
  4. DNA hybridization in the apes -- Technical issues
  5. S.S. Socransky, A.D. Haffajee, C. Smith, L. Martin, J.A. Haffajee, N.G. Uzel, J. M. Goodson (2004.). „Use of checkerboard DNA–DNA hybridization to study complex microbial ecosystems”. Oral Microbiology and Immunology 19 (6), 352–362. o. DOI:10.1111/j.1399-302x.2004.00168.x.  
  6. THE DNA-DNA HYBRIDIZATION TECHNIQUE: Methods and discussions about groups, by Dr. Charles G. Sibley